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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2012年第12期40卷 79-84页

作者：赵艳孙天国王慧张梅娟崔巍沙伟齐齐哈尔大学生命科学与农林学院遗传重点实验室黑龙江齐齐哈尔161006

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到... 详细信息

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。

关键词：大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子瞬时表达

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棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在毕赤酵母中的表达

棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在毕赤酵母中的表达

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作者：杨晓雪哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

木霉菌（Trichoderma spp.）是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌,含有很多优良的生物防治基因,棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因就是其中之一。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）是一类重要的蛋白水解酶,参与机体的新陈代谢及生物... 详细信息

木霉菌（Trichoderma spp.）是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌,含有很多优良的生物防治基因,棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因就是其中之一。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）是一类重要的蛋白水解酶,参与机体的新陈代谢及生物调控作用。它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。能够降解抗原,促进其他酶的活化,位点特异性水解逆转录酶病毒前体蛋白以产生病毒体复制所必须的酶蛋白等等。天冬氨酸蛋白酶广泛存在于病毒、真菌、哺乳动物及植物中,参与多种生理过程。天冬氨酸蛋白酶在生物防治等方面具有巨大的应用潜力。为了利用重组天冬氨酸蛋白酶生产广谱抗性的生物农药,本研究采用易于培养、外源蛋白表达量高的毕赤酵母（Pichia pastoris）作为表达生产工具,从已构建好的质粒p1762-mAsp中通过设计的引物扩增出棘孢木霉的mAsp基因,将经EcoR I和Not I双酶切的mAsp基因和酵母表达载体pPIC9K进行体外连接,构建酵母重组表达载体,经过菌液PCR检测,双酶切检测并测序,得到有正确阅读框的重组表达质粒pPIC9K-mAsp。将pPIC9K-mAsp和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶Sac I线性化后,采用电转化的方法转化GS115酵母感受态细胞,经过甲醇利用表型的筛选和PCR检测筛选得到2株高效利用甲醇和1株低效利用甲醇的GS115型阳性转化子。通过检测各转化子发酵液上清每隔24h的蛋白表达情况和酶活情况筛选出高效表达天冬氨酸蛋白酶的工程菌株Ga-2和Ga-5。对两株工程菌株分泌的重组mAsp粗酶液进行了酶活测定与酶学特性研究,同时对于重组mAsp的抑菌性进行了初步摸索。发现转化子Ga-2和Ga-5的产酶高峰出现在3d左右。确定酶系统发挥活性的最佳组合,即温度40℃,pH值4.0,依照该体系以酪氨酸为底物测得的重组蛋白酶发酵液酶活能达到31.6μ/g。重组天冬氨酸蛋白酶粗酶液对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的生长具有一定抑制作用,从而证明了重组蛋白酶具有一定的抑菌能力。用观察菌丝团大小的方法进行重组天冬氨酸蛋白酶粗酶液对病原菌抑菌实验,结果显示其对稻瘟病菌菌丝团的生长具有一定抑制作用,为今后的抑菌研究提供了新的方法,也为生物农药酶制剂研究打下基础。棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物同样具有抑制真菌生长的优良特性,这就预示了表达天冬氨酸蛋白酶在工业和生物学领域的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行改造,寻找合适的发酵工艺、探索使酶活稳定的方法,获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株,生产针对植物真菌病害防治的生物农药。

关键词：棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因酵母表达酶学特性生物防治

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饲料中添加复合芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗病毒感染能力及抗病基因表达的影响

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渔业科学进展 2019年第3期40卷 113-121页

作者：孙博超杨运楷李玉宏宋晓玲黄倢上海海洋大学上海201306 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071

自健康凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分离到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(***)和短小芽孢杆菌(***),将上述芽孢杆菌以单一和3株复合的方式包裹在基础饲料表面,制成益生菌饲料;每日投喂对虾,3周后进行白斑综合征病... 详细信息

自健康凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分离到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(***)和短小芽孢杆菌(***),将上述芽孢杆菌以单一和3株复合的方式包裹在基础饲料表面,制成益生菌饲料;每日投喂对虾,3周后进行白斑综合征病毒(WSSV)人工感染。统计实验组和对照组的累积死亡率,测定对虾鳃组织内WSSV拷贝数,分析对虾肠道组织含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶基因(Caspase)和硫氧还原蛋白基因(Trx)的相对表达量。结果显示,感染实验结束时,A组(枯草芽孢杆菌)、B组(地衣芽孢杆菌)、C组(短小芽孢杆菌)和D组(枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+短小芽孢杆菌复合益生菌)的对虾累积死亡率分别为(73.3±7.0)%、(63.3±5.5)%、(75.0±7.9)%和(50.0±5.3)%,显著低于对照组(PBS组)(100%);在整个感染阶段,各实验组的病毒拷贝数呈先上升后下降的趋势,但对照组呈现一直上升趋势,且显著高于实验组。抗病基因表达结果显示,WSSV感染后,各组对虾肠道Caspase相对表达量随感染时间的延长呈先上调再下调的趋势,且在18 h各组对虾肠道Caspase表达量达到最大值;益生菌摄取和WSSV感染都能刺激Trx的表达,益生菌的刺激相对平缓,且各实验组对虾肠道Trx相对表达量在WSSV感染后的18 h时陡升到最大值,极显著高于对照组,且以D组的激活能力最强。研究证实,枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均可提高对虾抗WSSV感染能力,复合芽孢杆菌抗病毒能力最突出。对虾抗病力的提高可能与芽孢杆菌减缓了病毒在靶组织的增殖速率、提高了Caspase和Trx基因表达水平相关。

关键词：凡纳滨对虾芽孢杆菌 WSSV 天冬氨酸蛋白酶基因硫氧还原蛋白基因定量PCR

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