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槲皮素对大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤的防护作用

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营养学报 2007年第3期29卷 288-291页

作者：刘爽姚平李珂林杰郝丽萍刘烈刚华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生学系武汉430030

目的:观察槲皮素(quercetin)对大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤的防护作用。方法:经二步胶原酶技术分离培养大鼠原代肝细胞,用100mmol/L无水乙醇染毒细胞8h,作为酒精损伤模型。乙醇染毒前经不同剂量槲皮素(25～200μmol/L)预作用不同时间(... 详细信息

目的:观察槲皮素(quercetin)对大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤的防护作用。方法:经二步胶原酶技术分离培养大鼠原代肝细胞,用100mmol/L无水乙醇染毒细胞8h,作为酒精损伤模型。乙醇染毒前经不同剂量槲皮素(25～200μmol/L)预作用不同时间(0～8h),观察槲皮素干预对细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)活性,丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性的影响。结果:大鼠原代肝细胞经100mmol/L酒精暴露8h后,LDH、AST活性,MDA、GSH含量和SOD、CAT活性与对照组相比,均有非常显著性差异;酒精暴露前1～4h经50～75μmol/L槲皮素干预效果最明显,LDH、AST、MDA和GSH、SOD、CAT水平分别较酒精组非常显著性降低和升高。结论:槲皮素可能通过减少GSH耗竭,提高抗氧化酶活性,抑制脂质过氧化来保护大鼠原代肝细胞抗酒精性氧化损伤,保护作用呈剂量与时间效应关系。

关键词：大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤槲皮素

汉防己甲素诱导大鼠原代肝细胞线粒体途径的凋亡:依赖于caspase和由Endonuclease G(Endo G)介导的不依赖于caspase的凋亡途径

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毒理学杂志 2005年第A3期19卷 219-220页

作者：蔡燕戚新明宫丽崑任进中国科学院上海生命科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室上海201203

目的汉防己甲素(Tetrandrine,Tet)具有广泛的药理学作用,但其肝毒性机制尚不明确.本实验主要探讨了汉防己甲素诱导的大鼠原代肝细胞线粒体功能紊乱和经由线粒体途径的细胞凋亡.

关键词：汉防己甲素大鼠原代肝细胞线粒体凋亡

苍耳子及苍术苷对大鼠原代肝细胞的毒性作用研究

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中药药理与临床 2012年第3期28卷 36-39页

作者：鄢良春张婷婷吴懿赵军宁宋军华桦李莉四川省中医药科学院药理毒理研究所国家中医药管理局中药质量生物评价重点研究室四川省道地药材系统开发工程技术研究中心中药品质评价与创新中药研究四川省重点实验室成都610041 河南省食品药品检验所郑州450001 康哲药业股份有限公司深圳518057

目的:研究苍耳子水提物及苍术苷对大鼠原代肝细胞的毒性效应,探讨其可能的毒性机制。方法:制备大鼠原代肝细胞,观察苍耳子水提物及苍术苷在不同时间点对肝细胞形态的影响,并测定不同时间点培养液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(L... 详细信息

目的:研究苍耳子水提物及苍术苷对大鼠原代肝细胞的毒性效应,探讨其可能的毒性机制。方法:制备大鼠原代肝细胞,观察苍耳子水提物及苍术苷在不同时间点对肝细胞形态的影响,并测定不同时间点培养液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)及尿素氮(BUN)的含量。结果:药物作用24h后,各给药组肝细胞均出现不同程度的形态改变及死亡,并随时间的增加细胞死亡数量亦增加,48h时,苍术苷和水提物低浓度组仍可见少量活细胞,而水提物高浓度组肝细胞几乎已全部死亡。ALT和LDH在给药2h或24h出现升高,含量呈时间依赖性增加,ALB和BUN在给药2h出现降低,在所试时间内一直处于较低水平。结论:苍耳子水提物0.18、0.018 g原生药/ml及苍术苷44μg/ml对大鼠原代肝细胞有明显的毒性。

关键词：苍耳子苍术苷大鼠原代肝细胞毒性作用

改良后的大鼠原代肝细胞分离方法应用于格列喹酮肝摄取方式的考察

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中国医院药学杂志 2015年第9期35卷 809-812页

作者：张帆敬涛白兆迪唐梅周利婷武新安兰州大学第一医院甘肃兰州730000 兰州大学第一临床医学院甘肃兰州730000 兰州大学药学院甘肃兰州730000

目的：对分离大鼠原代肝细胞的经典方法进行改良,使之更方便、高效、经济和实用;并将方法改良后分离获得的原代肝细胞进行贴壁培养用于格列喹酮的肝细胞摄取方式的考察。方法：将雄性Wistar大鼠于无菌条件下麻醉后固定,保持体温在37℃,... 详细信息

目的：对分离大鼠原代肝细胞的经典方法进行改良,使之更方便、高效、经济和实用;并将方法改良后分离获得的原代肝细胞进行贴壁培养用于格列喹酮的肝细胞摄取方式的考察。方法：将雄性Wistar大鼠于无菌条件下麻醉后固定,保持体温在37℃,对Seglen两步在体灌注分离原代肝细胞方法进行改进,采用先在体后离体的方法分离大鼠原代肝细胞,离心纯化后进行贴壁培养;将不同浓度格列喹酮溶液与贴壁的原代肝细胞共同孵育40 min,1%Trion-X100裂解后,高效液相色谱-荧光法测定肝细胞裂解液中格列喹酮的浓度,BCA法测定细胞蛋白含量,绘制格列喹酮大鼠原代肝细胞摄取曲线,考察格列喹酮的肝细胞摄取方式。结果：经改良后,所分离的大鼠原代肝细胞数量有所提高,活性〉80%,易于贴壁,形态良好,且节省试剂尤其是Ⅳ型胶原酶的用量;在15.625-720μg·ml^-1范围内时,随着格列喹酮浓度的增大肝细胞对格列喹酮的摄取量呈近似线性的升高,并未呈现明显的饱和现象。结论：经典方法经改良后,分离获得的肝细胞活性高且易于贴壁,同时操作更为方便、高效,节约试剂尤其是昂贵的Ⅳ型胶原酶的用量,是较为经济、实用的方法;格列喹酮在15.625-720μg·ml^-1范围内时,肝细胞对其摄取以自由扩散为主并非蛋白介导转运。

关键词： Seglen法大鼠原代肝细胞格列喹酮肝摄取高效液相色谱-荧光法

原儿茶酸对HepG2.2.15细胞和大鼠原代肝细胞膜转运蛋白mRNA表达的影响

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中华中医药杂志 2011年第11期26卷 2555-2558页

作者：孟沫然王俊俊蔡文涛陈勇韩凤梅湖北大学中药生物技术省重点实验室武汉430062

目的:研究原儿茶酸(PA)对HepG2.2.15细胞和大鼠原代肝细胞细胞膜上P糖蛋白(P-gp)、阴离子转运蛋白(Oatp1A1)和阳离子转运蛋白(Oct1)mRNA表达水平的影响。方法:HepG2.2.15细胞和大鼠原代肝细胞经不同浓度PA处理后,用荧光定量PCR检测细胞... 详细信息

目的:研究原儿茶酸(PA)对HepG2.2.15细胞和大鼠原代肝细胞细胞膜上P糖蛋白(P-gp)、阴离子转运蛋白(Oatp1A1)和阳离子转运蛋白(Oct1)mRNA表达水平的影响。方法:HepG2.2.15细胞和大鼠原代肝细胞经不同浓度PA处理后,用荧光定量PCR检测细胞膜上P-gp、Oatp1A1和Oct1 mRNA的表达量。结果:HepG2.2.15细胞经PA处理48h后,低浓度PA(0.5μg/mL)显著下调P-gp和Oatp1A1 mRNA的表达,高浓度PA(50μg/mL)显著上调P-gp和Oatp1A1 mRNA的表达;低、中、高浓度PA均显著上调Oct1 mRNA的表达。大鼠原代肝细胞经PA处理48h后,低浓度PA(0.5μg/mL)显著下调Oatp1A1和Oct1 mRNA的表达,高浓度PA(50μg/mL)显著上调Oatp1A1和Oct1 mRNA的表达。结论:PA对HepG2.2.15细胞和大鼠原代肝细胞膜上P-gp、Oatp1A1和Oct1 mRNA的表达有显著影响,提示当PA与上述转运体底物药物共用时,可能会发生药物吸收相互作用。

关键词：原儿茶酸 HepG2.2.15细胞大鼠原代肝细胞 P糖蛋白阴离子转运蛋白1A1 阳离子转运蛋白1

2D、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞在药物肝毒性评价中的比较研究

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2D、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞在药物肝毒性评价中的比...

作者：李曼广东药科大学

学位级别：硕士

目的建立大鼠原代肝细胞提取鉴定体系,比较对乙酰氨基酚作用于2D培养的大鼠原代肝细胞、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的毒性特点。方法采用胶原酶原位两步灌流法提取大鼠原代肝细胞,并通过PAS糖原染色和肝细胞双核结构进行鉴定;... 详细信息

目的建立大鼠原代肝细胞提取鉴定体系,比较对乙酰氨基酚作用于2D培养的大鼠原代肝细胞、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的毒性特点。方法采用胶原酶原位两步灌流法提取大鼠原代肝细胞,并通过PAS糖原染色和肝细胞双核结构进行鉴定;以光学显微镜和扫描电子显微镜来观察3D培养的大鼠原代肝细胞在cellusponge海绵支架上的生长情况。应用CCK8法对2D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的生长规律进行研究;以肝毒性药物对乙酰氨基酚(APAP)为阳性药,用CCK8法测定2D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的IC50,并对其毒性作用规律进行研究;通过光学显微镜、HE染色和透射电镜来观察药物对两种细胞的损伤情况。以全自动生化分析仪来检测药物作用三种细胞模型之后细胞上清AST、ALT、LDH、ALP、ALB、BUN、TP、GLU生化指标的变化。结果每只SD大鼠可获得(100-300)×106个细胞,细胞活率浮动在80%-95%,PAS糖原染色显示阳性,光学显微镜下观察大量细胞为双核结构,鉴定为大鼠原代肝细胞。2D培养的大鼠原代肝细胞最佳接种密度为60000个/cm2,最佳液面深度为1.5mm,接种4h之后开始贴壁,接种24小时大部分贴壁,48h完全贴壁,可见细胞连成岛状结构,接种第一天细胞数量略有下降,在第3-5天进入对数生长期,第7天开始进入衰退期;大鼠原代肝细胞在以cellusponge为支架的三维培养系统中培养时,在培养24h之后即有部分细胞聚集成团,培养三天之后大部分细胞形成团,培养5天之后细胞形成直径约70mm的细胞团,培养第7天细胞形成直径大约100mm-150mm的细胞团。BRL-3A细胞根据接种密度的不同,潜伏期和对数期持续长短各不相同,最佳的接种密度在(1-2)×104个/m L,接种48h后进入对数生长期,持续约3天。APAP作用于大鼠原代肝细胞24h的IC50为18.03mmol/L,95%CI=(17.28,18.81)mmol/L,作用于BRL-3A的IC50为20.05mmol/L,95%CI=(18.99,21.17)mmol/L,APAP对2D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A的毒性作用随着作用时间延长而增大,相同时间内,毒性作用呈现剂量依赖性。对BRL-3A的HE染色结果显示低浓度组细胞胞核圆形、卵圆形或不规则形,胞浆宽窄均一,核浆比例均匀,可见分裂核;高浓度组细胞散在,可见弥漫分布,细胞明显淡染,结构不清,细胞核几乎不可见。透射电镜结果显示,30mmol/L的APAP对2D培养的原代大鼠肝细胞和BRL-3A细胞造成细胞器肿胀,核膜破裂,细胞膜边界模糊不清;随着药物剂量的增加,与对照组相比,大鼠原代肝细胞10、25、30 mmol/L组的AST和所有给药组的GLU显著升高(P细胞各剂量组的GLU、AST并未发生显著改变。3D培养的大鼠原代肝细胞暴露于5m M、20m M、30m M的低中高浓度APAP作用下,随着药物浓度增大,其ALB、BUN含量显著降低,AST、GLU、AST显著升高,低、中浓度组的LDH显著升高,低浓度组的ALP和TP显著升高。结论永生化细胞BRL-3A和2D、3D培养的大鼠原代肝细胞暴露于肝毒性药物对乙酰氨基酚时,与BRL-3A相比,二维培养的大鼠原代肝细胞酶学指标变化较为丰富,但其体外培养存活时间较短;BRL-3A细胞缺少肝脏重要酶类,增加永生化细胞BRL-3A肝脏酶类是提升BRL-3A细胞作为肝脏毒性筛选模型的更好手段之一;原代大鼠肝细胞三维培养模型的酶学指标变化最丰富,与在体肝脏功能最为接近,是三种模型中较为理想的肝毒性评价模型。

关键词：药物肝毒性大鼠原代肝细胞 BRL-3A细胞 3D培养对乙酰氨基酚

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蛇床子素在大鼠原代肝细胞中代谢的研究

蛇床子素在大鼠原代肝细胞中代谢的研究

作者：张丽芳南昌大学

学位级别：硕士

目的采用大鼠原代肝细胞体外温孵液对蛇床子素(Ost)在肝细胞中代谢转化过程进行研究。分析Ost在大鼠肝细胞中的代谢途径和机制,探讨Ost在CYP450酶系相关亚型中的代谢,及CYP450酶诱导剂和抑制剂对Ost代谢的影响。为更深入地研究Ost的药... 详细信息

目的采用大鼠原代肝细胞体外温孵液对蛇床子素(Ost)在肝细胞中代谢转化过程进行研究。分析Ost在大鼠肝细胞中的代谢途径和机制,探讨Ost在CYP450酶系相关亚型中的代谢,及CYP450酶诱导剂和抑制剂对Ost代谢的影响。为更深入地研究Ost的药动学及其临床上合理用药提供理论和实验依据。方法①建立大鼠原代肝细胞的分离方法和大鼠肝细胞体外温孵体系。通过台盼蓝排斥实验、光学显微镜、透射电镜检查、HE染色对肝细胞的产率,活力,细胞的形态、超微结构等指标进行测定。②通过MTT方法测定不同浓度Ost对大鼠原代肝细胞活力的影响。③建立Ost的HPLC-UV检测方法。④通过温孵时间、肝细胞含量、底物浓度三个方面来考察Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中的酶促动力学特征。⑤研究CYP3A4诱导剂利福平(Rif)、CYP2D6抑制剂育亨宾(Yoh)、CYP2C9抑制剂磺胺嘧啶(Sul)、CYP2C8抑制剂槲皮素(Que)对Ost在大鼠肝细胞温孵液中代谢的影响。⑥选择CYP3A4特异性抑制剂醋竹桃霉素(Tro),观察其对Ost体外代谢的抑制效应。结果①建立了成熟的大鼠原代肝细胞的分离方法和大鼠原代肝细胞温孵体系,肝细胞产率为1-2x108/肝,肝细胞活力和纯度均在90%以上。②Ost的浓度在0-20μM范围内对大鼠原代肝细胞活力与空白对照组相比,未见显著影响,肝细胞活力>80%。③Ost的HPLC检测方法为流动相:甲醇:双蒸水=80:20(V/V);流速:1.0 ml/min;检测波长:322nm;灵敏度:0.004 Aufs。④Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中呈现明显的酶促动力学特征:当Ost的浓度在0-10μM,Ost的代谢呈浓度依赖性,代谢消除量随底物浓度增加呈线性增加;当浓度超过10μM,Ost代谢出现饱和现象,代谢消除量不再随着底物浓度的增加而增加。Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中经37℃空气浴振荡器振荡孵育15～120min,呈时间依赖性线性消除。温孵液中肝细胞的浓度在5x105～1x107/ml范围内,Ost的代谢量随肝细胞浓度增加而增加,呈线性消除。⑤CYP2D6抑制剂Yoh、CYP2C9抑制剂Sul、CYP2C8抑制剂Que对Ost的代谢消除率的影响与对照组相比无明显区别(P>0.05),在与CYP3A4诱导剂Rif共孵育的肝细胞温孵液中Ost的代谢消除率与对照组相比具有显著性差异(P大鼠肝细胞中的代谢。结论本实验建立的大鼠原代肝细胞分离方法和肝细胞体外温孵液稳定、可靠,能满足本实验药物代谢的要求。Ost在大鼠肝细胞体外温孵液代谢实验研究提示Ost的代谢具有酶促动力学代谢特征。CYP2D6抑制剂Yoh、CYP2C9抑制剂Sul、CYP2C8抑制剂Que不抑制Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中的代谢。CYP3A4诱导剂Rif则明显诱导Ost的代谢;CYP3A4抑制剂Tro呈剂量依赖性抑制Ost的代谢。CYP3A4可能是介导Ost在大鼠体内代谢的CYP450酶。

关键词：蛇床子素高效液相色谱细胞色素P450 药物代谢大鼠原代肝细胞

对乙酰氨基酚对大鼠原代肝细胞及BRL-3A细胞的毒性作用比较

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药物评价研究 2016年第3期39卷 349-356页

作者：李曼吴纯启许赫雷谢丽华韩刚王全军王茜莎广东药科大学药科学院广东广州510006 军事医学科学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室国家北京药物安全评价研究中心北京100850

目的建立大鼠原代肝细胞提取鉴定体系,比较对乙酰氨基酚（APAP）对大鼠原代肝细胞和永生化细胞BRL-3A的毒性作用。方法采用胶原酶原位两步灌流法提取大鼠原代肝细胞,通过过碘酸雪夫染色（PAS）和肝细胞双核结构进行鉴定;CCK 8法测定APA... 详细信息

目的建立大鼠原代肝细胞提取鉴定体系,比较对乙酰氨基酚（APAP）对大鼠原代肝细胞和永生化细胞BRL-3A的毒性作用。方法采用胶原酶原位两步灌流法提取大鼠原代肝细胞,通过过碘酸雪夫染色（PAS）和肝细胞双核结构进行鉴定;CCK 8法测定APAP对大鼠原代肝细胞及BRL-3A细胞毒性作用的IC50;光学显微镜透射电镜观察APAP对2种细胞的损伤情况;全自动生化分析仪测定细胞上清AST、ALT、LDH、ALP、ALB、BUN、TP、GLU 8项生化指标的变化。结果PAS糖原染色鉴定获取的大鼠原代肝细胞,双核结构,细胞存活率浮动在80%~95%;最佳接种密度为60 000/cm^2,在第3~5天为对数生长期;APAP作用于大鼠原代肝细胞24 h的IC50为18.03 mmol/L,95%置信区间为（17.28~18.81）mmol/L,作用于BRL-3A的IC_（50）为20.05 mmol/L,95%置信区间为（18.99~21.17）mmol/L;透射电镜结果显示,在30 mmol/L APAP作用下,2种细胞细胞器肿胀,核膜破裂,细胞膜边界模糊不清;与对照组比较,大鼠原代肝细胞分泌的天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）随着APAP浓度增加产生显著变化,而BRL-3A细胞几乎所有的酶学指标变化均差异不显著。结论与永生化细胞BRL-3A比较,大鼠原代肝细胞更能体现药物的肝脏毒性作用,但其体外培养存活时间较短;BRL-3A细胞缺少肝脏重要酶类,增加细胞内肝脏酶类是提升其作为肝脏毒性筛选模型的更好手段之一。

关键词：大鼠原代肝细胞原代培养 BRL-3A细胞对乙酰氨基酚肝毒性

circMTO1靶向miR-384减轻氯氮平致大鼠原代肝细胞损伤的机制研究

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毒理学杂志 2023年第1期37卷 31-36页

作者：张卫华张子雯张鹏江西省宜春学院医学院江西宜春336000

目的探讨环状RNA(circRNA)circMTO1对氯氮平致大鼠原代肝细胞损伤的影响及分子机制。方法将大鼠原代肝细胞随机分为对照组、氯氮平组、氯氮平+pcDNA3.1组、氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组、氯氮平+miR-NC组、氯氮平+miR-384组和氯氮平+pc... 详细信息

目的探讨环状RNA(circRNA)circMTO1对氯氮平致大鼠原代肝细胞损伤的影响及分子机制。方法将大鼠原代肝细胞随机分为对照组、氯氮平组、氯氮平+pcDNA3.1组、氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组、氯氮平+miR-NC组、氯氮平+miR-384组和氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1+miR-384组。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验检测细胞存活率,实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测circMTO1和miR-384表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平,双荧光素酶报告实验验证circMTO1与miR-384的靶向关系。结果对照组、氯氮平组、氯氮平+pcDNA3.1组、氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组、氯氮平+miR-NC组、氯氮平+miR-384组和氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1+miR-384组大鼠原代肝细胞存活率依次为100.00%±5.37%、53.09%±8.71%、58.71%±9.26%、80.25%±12.71%、56.07%±8.02%、39.01%±5.64%、61.24%±8.35%,凋亡率依次为5.53%±0.93%、37.26%±6.20%、41.18%±5.60%、19.87%±3.03%、38.96%±5.02%、53.24%±6.01%和32.69%±4.17%。与对照组比较,氯氮平组大鼠原代肝细胞存活率和circMTO1表达水平明显降低,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显增加(P大鼠原代肝细胞存活率和circMTO1表达水平明显增加,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显降低(P大鼠原代肝细胞存活率明显降低,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显增加(P大鼠原代肝细胞存活率明显降低,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显增加(P大鼠原代肝细胞circMTO1表达水平、细胞存活率明显增加,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显降低(P大鼠原代肝细胞损伤,其机制可能与circMTO1靶向负调控miR-384的表达有关。

关键词： circMTO1 miR-384 氯氮平大鼠原代肝细胞凋亡