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大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及抗血清制备

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第10期32卷 1407-1411页

作者：周小愿张星朗贾秋红韩亚慧高宏伟中国水产科学院黄河水产研究所养殖与渔业工程研究室陕西西安710086

目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫... 详细信息

目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法检测重组蛋白的表达和免疫活性,用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原免疫兔制备抗血清,采用Western blot法和ELISA检测抗血清的免疫特异性并测定效价,利用间接免疫荧光法检测鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞CGSIV。结果表达了相对分子质量(Mr)为29 000的重组蛋白。制备的兔抗MCP血清具有良好的特异性和高滴度,间接免疫荧光法检测结果显示制备的多抗血清能识别EPC细胞中的CGSIV。结论成功表达了大鲵虹彩病毒MCP主要抗原表位区蛋白,并制备高滴度和良好特异性的兔抗血清。

关键词：大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区原核表达抗血清

大鲵虹彩病毒流行株的分离及其主衣壳蛋白编码基因序列比较分析

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中国水产科学 2014年第4期21卷 655-660页

作者：徐进张辉肖汉兵曾令兵中国水产科学研究院长江水产研究所

大鲵虹彩病毒（giant salamander iridovirus,GSIV）是近年中国大陆新发现的引起人工养殖大鲵（Andrias davidianus）大规模死亡的病毒病原。为了揭示大鲵虹彩病毒流行株的基因型差异,本研究对2010–2012年采集自全国不同大鲵养殖区域... 详细信息

大鲵虹彩病毒（giant salamander iridovirus,GSIV）是近年中国大陆新发现的引起人工养殖大鲵（Andrias davidianus）大规模死亡的病毒病原。为了揭示大鲵虹彩病毒流行株的基因型差异,本研究对2010–2012年采集自全国不同大鲵养殖区域的患虹彩病毒病的大鲵样本进行了分子检测、病毒分离培养以及病毒主衣壳蛋白（major capsid protein,MCP）基因测序与比对分析。结果显示,采自陕西、湖北、湖南、浙江、江西、福建等省的10个样本检测为阳性,通过细胞培养获得10株病毒流行株。对该10株流行株MCP基因的测序与比对分析发现,核苷酸序列相似性达到99.7%;00%,其推测的氨基酸序列无明显差异,证实中国大鲵虹彩病毒流行株属同一基因型。系统进化树分析结果表明,所选大鲵虹彩病毒与蛙病毒分别聚为一枝,但其亲缘关系较近。本研究结果旨为大鲵虹彩病毒病的疫苗研制及其免疫防控技术研究奠定基础。

关键词：大鲵虹彩病毒流行株主衣壳蛋白基因序列比对分析

大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

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淡水渔业 2017年第2期47卷 18-22页

作者：余波王芳康超李永霞周思旋贵州省畜牧兽医研究所贵阳550005 贵州省生物研究所贵阳550009

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进... 详细信息

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。

关键词：大鲵虹彩病毒 MCP基因原核表达免疫原性

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大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究

淡水渔业 2012年第5期42卷 17-21,26页

作者：高正勇曾令兵肖汉兵张辉孟彦肖艺徐进中国水产科学研究院长江水产研究所农业部长江流域水生动物疫病重点实验室湖北武汉430223

对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58... 详细信息

对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明,GSIV可在鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)、斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK)、虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,TCID50高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后TCID50开始快速上升,进入对数增长期,72 h时TCID50达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。

关键词：大鲵虹彩病毒理化特性生物学特性

大鲵虹彩病毒套式PCR诊断方法的建立及应用

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江苏农业科学 2016年第8期44卷 291-293页

作者：王芳康超李永霞余波周思旋贵州省生物研究所贵州贵阳550009 贵州省畜牧兽医研究所贵州贵阳550005

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列,设计2对特异性的引物,通过对第1步和第2步PCR反应条件进行优化,建立大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白套式PCR诊断方法。结果表明,该方法重复性好,第1次PCR扩增敏感性达10 pg/m L,第2次PCR... 详细信息

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列,设计2对特异性的引物,通过对第1步和第2步PCR反应条件进行优化,建立大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白套式PCR诊断方法。结果表明,该方法重复性好,第1次PCR扩增敏感性达10 pg/m L,第2次PCR敏感性是1 fg/m L,对锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾病毒、嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌、黄杆菌DNA扩增结果均为阴性。表明建立的套式PCR方法适合于大鲵虹彩病毒临床样品的快速诊断。

关键词：大鲵虹彩病毒套式PCR 临床样品

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大鲵虹彩病毒等温扩增可视化检测方法的建立

大鲵虹彩病毒等温扩增可视化检测方法的建立

作者：张浩河南农业大学

学位级别：硕士

大鲵虹彩病毒病是由大鲵虹彩病毒(Giant Salamander Iridovirus,GSIV)感染引起的恶性传染病,传播速度很快,致死率极高,给大鲵养殖行业带来重大经济损失。现有的检测方法大多依赖于实验室仪器设备和专业人员的操作,严重制约了日常养殖中... 详细信息

大鲵虹彩病毒病是由大鲵虹彩病毒(Giant Salamander Iridovirus,GSIV)感染引起的恶性传染病,传播速度很快,致死率极高,给大鲵养殖行业带来重大经济损失。现有的检测方法大多依赖于实验室仪器设备和专业人员的操作,严重制约了日常养殖中对大鲵虹彩病毒的监控和防治。本研究利用单交叉引物等温扩增技术(Single Crossing Priming Amplification,SCPA)和重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),结合核酸快速检测试纸,建立了两种简单快速、肉眼可视化的GSIV现场检测方法,为大鲵虹彩病毒的防控提供技术支持。本论文研究的主要内容如下:1.建立大鲵虹彩病毒的单交叉引物GSIV-SCPA可视化检测方法针对GSIV基因组保守区的核衣壳蛋白MCP基因,设计并筛选用于SCPA的引物,并对SCPA基础反应体系的各组分浓度以及反应温度、时间进行优化,确定最佳反应条件。结果表明,当交叉引物2R1F的浓度为1.0μmol/L,特异引物(检测引物)2R(2R-Bio)和3R(3R-FAM)的浓度分别为0.5μmol/L,剥离引物4F和5R的浓度分别为0.6μmol/L,Mg浓度为8 mmol/L,d NTPs浓度为1.2 mmol/L,甜菜碱浓度为0.7 mol/L时,在63℃下恒温扩增40 min效果最佳,将SCPA扩增产物与核酸快速检测试纸相结合,建立用于大鲵虹彩病毒现场检测的GSIV-SCPA方法。使用大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV);真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV);虎纹蛙虹彩病毒(Tiger Frog Virus,TFV)以及锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus disease,KHVD)等相近种属病毒和水产养殖中常见病的病原检测基因的重组质粒对GSIV-SCPA方法的特异性进行评价,结果表明,GSIV-SCPA方法可特异性扩增GSIV的MCP基因,特异性良好;对GSIV-SCPA方法的灵敏度评价表明,GSIV-SCPA方法检测的检测极限为10拷贝数的标准质粒,PCR方法的检测极限为10拷贝数的标准质粒,证明GSIV-SCPA法的灵敏度高于PCR 10倍,可以检出微量的病毒DNA;在对送检的54份大鲵样品进行检测时,GSIV-SCPA方法的阳性率为72.22%(39/54),PCR方法的阳性率为74.07%(40/54),经统计学分析,GSIV-SCPA检测的敏感性为97.50%(39/40),特异性为92.86%(13/14),符合率为94.44%(51/54)。Kappa值为0.870,P大鲵虹彩病毒的重组酶聚合酶GSIV-RPA可视化检测方法针对GSIV基因组的保守区核衣壳蛋白MCP基因,设计用于RPA扩增的引物,经引物筛选后又对反应时间进行了优化;将RPA扩增产物与核酸快速检测试纸相结合,建立用于大鲵虹彩病毒现场检测的GSIV-RPA方法。使用大菱鲆红体病虹彩病毒TRBIV;真鲷虹彩病毒ISKNV;虎纹蛙虹彩病毒TFV以及锦鲤疱疹病毒等相近种属病毒的基因组DNA重组质粒对新建立的GSIV-RPA方法进行特异性评价,结果显示GSIV-RPA方法可特异性扩增GSIV的MCP基因,特异性良好;对GSIV-RPA方法的灵敏度评价表明,GSIV-RPA方法检测的检测极限为10拷贝数的标准质粒,PCR方法的检测极限为10拷贝数的标准质粒,证明GSIV-RPA法的灵敏度高于PCR 10倍,可以检出微量的病毒DNA;采集的54份大鲵样品诊断结果显示,GSIV-RPA方法的阳性率为72.22%(39/54),PCR方法的阳性率为74.07%(40/54),经统计学分析,GSIV-RPA检测的敏感性为97.50%(39/40),特异性为92.86%(13/14),符合率为94.44%(51/54)。Kappa值为0.870,P大鲵虹彩病毒的快速检测,提高日常养殖和引种过程中对大鲵虹彩病毒得监控效率,为大鲵虹彩病毒的快速诊断提供了技术支持。

关键词：大鲵虹彩病毒交叉引物重组酶聚合酶等温扩增核酸试纸快速检测

大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究

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大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗免疫应答机理与保护效果研究

作者：刘文枝上海海洋大学

学位级别：硕士

大鲵（Chinese giant salamander, Andrias davidianus），俗名“娃娃鱼”，是我国珍稀的名贵特产，具有很高的食用、科研及药用价值，属于国家二级保护动物，已被列入CITES公约附录Ⅰ中。大鲵虹彩病毒病是近年来我国大鲵养殖业中新暴... 详细信息

大鲵（Chinese giant salamander, Andrias davidianus），俗名“娃娃鱼”，是我国珍稀的名贵特产，具有很高的食用、科研及药用价值，属于国家二级保护动物，已被列入CITES公约附录Ⅰ中。大鲵虹彩病毒病是近年来我国大鲵养殖业中新暴发的一种高度传染性疾病，其病原为大鲵虹彩病毒（Giant salamanderiridovirus，GSIV），给大鲵养殖业造成了重大的经济损失，严重阻碍了大鲵养殖业的健康发展。免疫预防被认为是预防水生动物传染性疾病最为有效的方法。本论文对大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗的最适免疫剂量、大鲵免疫后的外周血免疫指标变化规律与保护效果以及免疫佐剂的增效作用等进行了研究，旨在建立一种大鲵虹彩病毒病的免疫预防技术。本论文的主要内容如下： 1.将健康大鲵80尾随机分成四组，分别以不同剂量（lg TCID50ml-1）的细胞培养灭活疫苗免疫大鲵。在免疫后7、14、21、28d，随机从各免疫组与对照组中选取两尾大鲵，尾静脉采血进行中和抗体滴度测定。免疫30d后，进行攻毒试验，每尾大鲵经腹腔注射100ul的1.0ⅹ106TCID50ml-1的GSIV，连续观察14d，记录死亡情况，评价不同剂量的疫苗免疫保护效果。结果显示，免疫剂量为1.0ⅹ106TCID50ml-1的试验组，在人工感染试验后，其相对免疫保护力可达72%。该结果为确定疫苗的最适免疫剂量提供了依据。 2.以β-丙内酯灭活的大鲵虹彩病毒（GSIV）通过腹腔注射途径免疫健康大鲵，分别于免疫后的1、2、4、7、14、21、28d采集试验大鲵外周血及组织样，进行血细胞计数和白细胞分类计数，测定细胞的吞噬活性、血清的抗体效价及免疫相关基因的变化，并在免疫后第30天进行攻毒感染试验。结果表明，与对照组相比，红细胞和白细胞数量分别在第4天和第7天呈极显著差异（P＜0.01）。此外，也引起中性粒细胞和单核细胞不同种类白细胞分类百分比的变化。中性粒细胞（neutrophil）分类百分比从第2天开始升高，第4天达到峰值，极显著高于对照组（P＜0.01）;单核细胞（monocyte）和中性粒细胞的变化趋势比较相似，第7天达到峰值，随后淋巴细胞大量增殖，第21天淋巴细胞分类百分比达峰值(70.45±7.52%)。免疫应答早期，吞噬细胞的吞噬活性也迅速提高，吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）第四天达峰值，分别为38.78±4.33%和3.75±0.52。血清微量中和试验结果表明，免疫后第21天抗体效价最高（341±9.52）。免疫相关基因表达检测结果显示，免疫4d后，免疫组TLR9在肾、脾脏中表达极显著高于对照组（P＜0.01），而MyD88在脾、肾脏中的表达量在免疫7d后极显著高于对照组（P＜0.01）。免疫大鲵的攻毒感染试验结果表明，相对保护率为72%。 3.以添加铝胶佐剂和弗氏完全佐剂的GSIV灭活疫苗，为两个试验组，设置无佐剂疫苗对照组和空白对照组（PBS）。分别在免疫后1～6周，每周随机从各免疫组与对照组中选取两尾大鲵，进行尾静脉采血，利用微量中和试验检测各个试验组的抗体水平变化。免疫60天后，进行攻毒感染试验，观察记录死亡状况，计算其相对免疫保护率，比较不同佐剂对GSIV灭活疫苗免疫效果的影响。结果表明，GSIV细胞培养灭活疫苗添加弗氏完全佐剂后，免疫大鲵产生的抗体效价最高（640±15.52），显著高于铝胶佐剂试验组与无佐剂疫苗对照组，且抗体滴度持续时间相对较长，其相对免疫保护率达到90%，显著高于铝胶佐剂试验组（84%）。该结果为使用GSIV灭活疫苗免疫大鲵时选择合适佐剂提供了一定的理论依据。

关键词：大鲵虹彩病毒灭活疫苗外周血免疫指标免疫剂量佐剂保护效果

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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湖北农业科学 2017年第21期56卷 4146-4150页

作者：黄谧冯勇武汉大学基础医学院武汉430071 湖北华大基因研究院武汉430075

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。

关键词：大鲵虹彩病毒衣壳蛋白原核表达多克隆抗体免疫检测

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大鲵感染虹彩病毒的诊断和治疗

河北渔业 2014年第12期 41-42,78页

作者：贾秋红黄河水产研究所陕西西安710086

2013年7月,陕西省汉中某大鲵养殖场发生以大鲵体表和四肢多处溃烂并伴有出血为特征的疾病,染病大鲵大量死亡。经临床观察、病理解剖及实验室检测,最后确诊病原为大鲵虹彩病毒。通过采取综合防治措施,养殖场大鲵疫情得到有效控制。

关键词：大鲵虹彩病毒诊断防治