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β-conglycinin酶解肽对仔猪空肠上皮细胞通透性及紧密连接蛋白表达的影响

畜牧兽医学报 2015年第5期46卷 768-773页

作者：刘丹丹赵元韩蕊张诗尧吉林农业大学动物科技学院动物生产及产品质量安全教育部重点实验室吉林省动物营养与饲料科学重点实验室长春130118

本研究通过测定大豆抗原β-conglycinin酶解肽(52ku)对仔猪空肠上皮细胞(IPEC)通透性及紧密连接蛋白Occludin与ZO-1基因mRNA表达的影响,为探索其对肠道损伤的相关机制提供依据。本试验分别采用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2mg·mL... 详细信息

本研究通过测定大豆抗原β-conglycinin酶解肽(52ku)对仔猪空肠上皮细胞(IPEC)通透性及紧密连接蛋白Occludin与ZO-1基因mRNA表达的影响,为探索其对肠道损伤的相关机制提供依据。本试验分别采用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2mg·mL-1)52ku酶解肽处理IPEC 2、4、6、8、12、24h后,通过测定细胞存活力(MTT值)、跨上皮细胞电阻值(TEER)以及细胞培养液中碱性磷酸酶(AP)的活性,检测52ku酶解肽对细胞膜通透性的影响。并选取0.5mg·mL-1 52ku酶解肽处理IPEC 24h后,用实时荧光定量PCR方法检测Occludin与ZO-1基因mRNA表达量的变化情况。结果表明,52ku酶解肽处理仔猪空肠上皮细胞后,MTT值和TEER呈时间-剂量依赖性降低(P<0.05)。24h处理后,AP活性呈显著升高趋势(P<0.05)。与对照组相比,52ku酶解肽可使Occludin和ZO-1基因mRNA相对表达量均呈显著下降趋势(P<0.05)。总之,52ku酶解肽使仔猪空肠上皮细胞通透性增加,并降低Occludin或ZO-1的mRNA表达。

关键词：大豆抗原β-conglycinin 52 ku酶解肽仔猪 IPEC 紧密连接

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β-伴大豆球蛋白及其酶解肽对仔猪空肠上皮细胞机械屏障功能损伤的比较研究

β-伴大豆球蛋白及其酶解肽对仔猪空肠上皮细胞机械屏障功能损伤...

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作者：刘丹丹吉林农业大学

学位级别：硕士

大豆抗原蛋白能够破坏仔猪等幼龄动物的肠道屏障功能,引起吸收障碍和腹泻,影响动物的生长发育,从而给畜牧业造成了重大损失。因此,本文选取大豆中主要抗原蛋白β-conglycinin及其酶解肽为致敏原,以仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为体外研究... 详细信息

大豆抗原蛋白能够破坏仔猪等幼龄动物的肠道屏障功能,引起吸收障碍和腹泻,影响动物的生长发育,从而给畜牧业造成了重大损失。因此,本文选取大豆中主要抗原蛋白β-conglycinin及其酶解肽为致敏原,以仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为体外研究模型,通过三个试验,研究了不同浓度的大豆抗原蛋白β-conglycinin及其酶解肽对IPEC-J2机械屏障功能损伤的影响,为进一步探究大豆对肠道损伤的相关机制提供依据。试验I:大豆抗原蛋白β-conglycinin酶解肽的分离、纯化及其免疫活性鉴定。本试验通过胃蛋白酶、胰蛋白酶连续水解β-conglycinin,采用凝胶层析技术及超滤法分离纯化酶解肽段,再通过SDS-PAGE电泳试验及Q-E质谱进行鉴定。结果表明:这三条酶解肽段的分子量分别为52kDa、30kDa、25kDa,并且均具有免疫活性,再通过凝胶层析技术分离纯化后,得到分子量为52kDa的酶解肽段,经超滤管超滤得到分子量为30kDa与25kDa酶解肽段的混合产物。试验II:不同浓度的大豆抗原蛋白β-conglycinin及其酶解肽对IPEC-J2通透性的影响。本试验分别采用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1或2 mg/mL)β-conglycinin及其酶解肽处理IPEC-J2不同时间(2 h、4 h、6 h、8 h、12 h或24 h)后,通过测定细胞存活力(MTT值),跨上皮细胞电阻值(TEER)以及细胞培养液中碱性磷酸酶(AP)的活性,检测β-conglycinin及其酶解肽对细胞通透性的影响。结果发现25+30kDa混合酶解肽对IPEC-J2的破坏程度最强,酶解总产物次之,各处理组之间差异显著(Pconglycinin及其酶解肽对IPEC-J2的MTT值与TEER值呈时间-剂量依赖性下降趋势(Pconglycinin及其酶解肽破坏了细胞增殖活力,从而对IPEC-J2屏障造成负面影响。试验III:β-conglycinin及其酶解肽对IPEC-J2紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-3、Claudin-4和ZO-1)的分布与相对表达量的影响。为了进一步验证β-conglycinin及其酶解肽对IPEC-J2机械屏障功能的损伤,本试验选用浓度为0.5mg/mLβ-conglycinin及其酶解肽处理IPEC-J2 24h后,采用免疫荧光法和Western Blot法检测紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-3、Claudin-4和ZO-1)在细胞中的分布及相对表达含量;结果发现β-conglycinin及其酶解肽刺激IPEC-J2后细胞间紧密连接处荧光染色程度降低且变得模糊和松散,通过Western Blot方法测得,紧密连接蛋白Occludin、Claudin-3、Claudin-4和ZO-1蛋白的相对表达量与对照组相比均有所下降(Pconglycinin及其酶解肽破坏了紧密连接蛋白完整性,使得上皮屏障及其防护功能受损。综上所述:β-conglycinin经消化酶水解后,对IPEC-J2械屏障功能的损伤能力加强。即:酶解肽对IPEC-J2的损伤程度高于β-conglycinin。而在各酶解肽段中,低分子量酶解肽破坏作用最为严重,酶解总产物次之、52kDa酶解肽较轻。以上研究结果为更进一步的揭示大豆的致敏机理提供依据。

关键词：大豆抗原β-conglycinin β-conglycinin酶解肽仔猪空肠上皮细胞机械屏障功能紧密连接

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β-conglycinin酶解肽对仔猪小肠上皮细胞紧密连接Occludin与ZO-1mRNA表达的影响

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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第七届中国饲料营养学术研讨会

作者：刘丹丹赵元韩蕊张诗尧吉林农业大学动物科技学院动物生产及产品质量安全教育部重点实验室吉林省动物营养与饲料科学重点实验室

本研究旨在以仔猪空肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,探究大豆抗原β-conglycinin酶解肽(52 kDa)对仔猪空肠上皮细胞完整性及紧密连接Occludin与Z()-1 mRNA表达的影响,进而为探索52kDa酶解肽对肠道损伤的相关机制提供依据。试验选取同代IPEC... 详细信息

本研究旨在以仔猪空肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,探究大豆抗原β-conglycinin酶解肽(52 kDa)对仔猪空肠上皮细胞完整性及紧密连接Occludin与Z()-1 mRNA表达的影响,进而为探索52kDa酶解肽对肠道损伤的相关机制提供依据。试验选取同代IPEC-J2细胞,在细胞培养液中添加不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL)的52 kDa酶解肽处理IPEC-J2细胞不同时间(2 h,4 h,6 h,8 h,12 h或24 h)后,测定细胞存活力(MTT值),跨上皮细胞电阻值(TEER),并采用试剂盒检测细胞培养液中碱性磷酸酶(AP)的活性,反映52 kDa酶解肽对细胞膜完整性的影响。并选取0.5 mg/mL 52 kDa酶解肽处理IPEC 24 h后,用实时荧光定量PCR方法检测其Occludin与ZO-1 mRNA表达量的变化情况。结果表明:(1)相同培养时间,随着52 kDa酶解肽浓度的增加,MTT值呈现下降趋势。0.25 mg/mL52 kDa酶解肽浓度处理PIEC 8 h后,MTT值显著降低(P0.05),其他浓度与对照组均达到极显著水平(Pconglycinin酶解肽能破坏仔猪IPEC的完整性,加大肠道通透性,破坏屏障功能,降低肠上皮紧密连接Occludin或ZO-1 mRNA的表达。

关键词：大豆抗原β-conglycinin 52 kDa酶解肽仔猪 IPEC-J2 紧密连接

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β-伴大豆球蛋白及其酶解肽对仔猪空肠上皮细胞机械屏障功能损伤的比较研究

β-伴大豆球蛋白及其酶解肽对仔猪空肠上皮细胞机械屏障功能损伤...

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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会

作者：赵元刘丹丹张诗尧潘丽娜仁高娃吉林农业大学动物科学科技学院动物生产及产品质量安全教育部重点实验室吉林省动物营养与饲料科学重点实验室

大豆抗原蛋白能够破坏仔猪等幼龄动物的肠道屏障功能,大豆抗原β-conglycinin经消化酶酶解后可产生三条主要酶解肽。因此,本文选取大豆中主要抗原蛋白β-conglycinin及其酶解肽为致敏原,以仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为体外研究模型采用... 详细信息

大豆抗原蛋白能够破坏仔猪等幼龄动物的肠道屏障功能,大豆抗原β-conglycinin经消化酶酶解后可产生三条主要酶解肽。因此,本文选取大豆中主要抗原蛋白β-conglycinin及其酶解肽为致敏原,以仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为体外研究模型采用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1或2 mg/mL)β-conglycinin及其酶解肽处理IPEC-J2不同时间(2、4、6、8、12或24 h)后,测定细胞存活力(MTT值),跨上皮细胞电阻值(TEER)以及细胞培养液中碱性磷酸酶(AP)的活性,检测β-conglycinin及其酶解肽对细胞通透性的影响,进而选用浓度为0.5 mg/mLβ-conglycinin及其酶解肽处理IPEC-J2 24h后,采用免疫荧光法和Western Blot法检测紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-3、Claudin-4和ZO-1)在细胞中的分布及相对表达含量。结果显示,(25+30)kD混合酶解肽对IPEC-J2的破坏程度最强,酶解总产物次之,且各组之间差异显著(Pconglycinin及其酶解肽对IPEC-J2的MTT值与TEER值呈时间-剂量依赖性下降趋势(Pconglycinin及其酶解肽刺激IPEG-J2后细胞间紧密连接处荧光染色程度降低且变得模糊和松散,通过Western Blot方法测得,紧密连接蛋白Occludin、Claudin-3、Claudin-4和ZO-1蛋白的相对表达量与对照组相比均有所下降(Pconglycinin经消化酶水解后,对IPEC-J2械屏障功能的损伤能力加强,即酶解肽对IPEC-J2的损伤程度高于β-conglycinin。而在各酶解肽段中,低分子量酶解肽破坏作用最为严重,酶解总产物次之,52 kD酶解肽较轻。以上研究结果为更进一步的揭示大豆的致敏机理提供依据。

关键词：大豆抗原β-conglycinin β-conglycinin酶解肽仔猪空肠上皮细胞机械屏障功能紧密连接

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