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IBV DNA疫苗重组质粒pVAX1-S1在大肠杆菌dh5α中的稳定性研究

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IBV DNA疫苗重组质粒pVAX1-S1在大肠杆菌DH5α中的稳定性研究

基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会...

作者：鲁丹王红宁高荣阳泰郭自成张云飞四川大学生命科学学院四川大学“动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室” 四川农业大学动物医学院

为保证DNA疫苗的质量,需要对重组质粒pVAX1-S1在重组大肠杆菌dh5a中的稳定性进行研究。成功构建了含IBV S1基因的真核表达质粒pVAX1-S1,将含有质粒pVAX1-S1的基因工程菌dh5α分别在含有和不含卡那霉素(Kan)的LB平板上划线接种连续传代.... 详细信息

为保证DNA疫苗的质量,需要对重组质粒pVAX1-S1在重组大肠杆菌dh5a中的稳定性进行研究。成功构建了含IBV S1基因的真核表达质粒pVAX1-S1,将含有质粒pVAX1-S1的基因工程菌dh5α分别在含有和不含卡那霉素(Kan)的LB平板上划线接种连续传代.结果表明,在含有Kan的LB平板上连续传代100代后,质粒的目的基因片断没有缺失,具有结构稳定性;但在无抗生素选择压力下,连续传代20代开始出现质粒丢失的细胞,连续传代100代后80%的细胞含有正常质粒.结论:本实验构建的IBV真核表达质粒pVAX1-S1在宿主菌dh5α中具有稳定性,为进一步扩大生产提供技术支持。

关键词： IBV S1 真核质粒大肠杆菌dh5α 稳定性

来源： cnki会议评论

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农业工程学报 2021年第1期37卷 299-305页

作者：刘变芳胡辉帆张义奎蔡锦杜双奎李俊丽曹梦茜吕欣西北农林科技大学食品科学与工程学院杨凌712100

为了预测和监控冷鲜猪肉储存过程中腐败细菌大肠杆菌的变化规律,评估产品货架期,建立微生物生长预测模型。该研究将绿色荧光蛋白质粒pGFP转入大肠杆菌dh5α,构建GFP的标记大肠杆菌。基于绿色荧光蛋白报告基因和氨苄青霉素抗性,采用稀释... 详细信息

为了预测和监控冷鲜猪肉储存过程中腐败细菌大肠杆菌的变化规律,评估产品货架期,建立微生物生长预测模型。该研究将绿色荧光蛋白质粒pGFP转入大肠杆菌dh5α,构建GFP的标记大肠杆菌。基于绿色荧光蛋白报告基因和氨苄青霉素抗性,采用稀释平板法定量追踪检测0~24℃条件下冷鲜猪肉中dh5α生长变化。采用Gompertz模型、平方根模型和响应面方程进行数据拟合,构建数学预测模型。结果表明Gompertz模型拟合效果良好,0~20℃条件下决定系数R^(2)为0.96~0.99。温度与最大比生长速率平方根、延迟期倒数平方根模型R^(2)分别为0.862、0.948。响应面模型揭示时间、温度对大肠杆菌的生长影响显著(P5),二者交互作用明显,响应面模型R^(2)为0.815。模型能够有效拟合冷鲜猪肉中与温度、时间相关的大肠杆菌的生长变化规律,研究结果为产品储存过程中细菌变化预测提供理论依据。

关键词：温度模型冷鲜猪肉大肠杆菌dh5α 追踪检测 Gompertz预测模型

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产异丁醇关键基因在大肠杆菌中表达的研究

微生物学通报 2012年第7期39卷 912-920页

作者：潘超强高强郑春阳孟庆艳段强冯少龙天津科技大学生物工程学院、工业发酵微生物教育部重点实验室、工业酶国家工程实验室天津300457 天津强微特生物科技有限公司天津300384

【目的】改造大肠杆菌缬氨酸合成途径,使其能够代谢合成异丁醇。【方法】将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)1.2829的2-酮异戊酸脱羧酶基因(kivD)和醇脱氢酶基因(adhA)串联克隆到大肠杆菌dh5α宿主中表达。【结果】经过改造的宿主菌发酵2... 详细信息

【目的】改造大肠杆菌缬氨酸合成途径,使其能够代谢合成异丁醇。【方法】将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)1.2829的2-酮异戊酸脱羧酶基因(kivD)和醇脱氢酶基因(adhA)串联克隆到大肠杆菌dh5α宿主中表达。【结果】经过改造的宿主菌发酵24 h后异丁醇产量为0.12 g/L。酶活测定实验发现,kivD和adhA基因在宿主菌中均得到表达,但由于KivD的低表达量导致宿主菌最终的异丁醇合成能力偏低。通过研究温度和pH对KivD和AdhA酶活的影响,最终选定二者的最适温度为30°C,最适pH为6.5。【结论】通过向宿主菌导入外源异丁醇合成基因能够改造其自身代谢途径,从而合成异丁醇。

关键词： 2-酮异戊酸脱羧酶醇脱氢酶大肠杆菌dh5α 异丁醇

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大肠杆菌数量动态变化体系的探究

实验教学与仪器 2019年第12期36卷 41-43页

作者：徐小金尹春跃浙江大学附属中学

利用重组大肠杆菌dh5α生长曲线的检测来构建关于"种群数量动态变化"实验体系,通过比浊法和稀释平板菌落计数法,加上琼脂凝胶检测辅助,可严谨地保障实验结果的准确性。实验结果表明,重组大肠杆菌dh5α的生长规律符合细菌的生长规律;而... 详细信息

利用重组大肠杆菌dh5α生长曲线的检测来构建关于"种群数量动态变化"实验体系,通过比浊法和稀释平板菌落计数法,加上琼脂凝胶检测辅助,可严谨地保障实验结果的准确性。实验结果表明,重组大肠杆菌dh5α的生长规律符合细菌的生长规律;而大肠杆菌相对于酵母,更加简便和节约时间;对于学生实验来说,可操作性更强。

关键词：大肠杆菌dh5α 酵母生长曲线比浊法稀释平板菌落计数法生长规律

GOD转基因酵母菌的构建及其重组GOD的表达分析

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GOD转基因酵母菌的构建及其重组GOD的表达分析

作者：刘旻兰州理工大学

学位级别：硕士

近年来,葡萄糖氧化酶(简称GOD)的用途越来越多,需求量也越来越大。而目前其生产主要采用胞内表达的发酵体系,大多数存在生产成本偏高,产出蛋白纯度不够高,产量偏低等问题。因此,借助基因工程手段构建优良的GOD产生菌株,并让它有效的高表... 详细信息

近年来,葡萄糖氧化酶(简称GOD)的用途越来越多,需求量也越来越大。而目前其生产主要采用胞内表达的发酵体系,大多数存在生产成本偏高,产出蛋白纯度不够高,产量偏低等问题。因此,借助基因工程手段构建优良的GOD产生菌株,并让它有效的高表达,具有重要意义。本论文采用巴斯德毕赤酵母(菌株GS115)做为表达菌种。巴斯德毕赤酵母的表达系统分胞内表达和分泌到胞外两种方式,所用发酵培养基简单有利于分离纯化,可以用甲醇做为一般碳源严格地调控外源基因的表达。所以本实验用SacI内切酶鉴定所保存的真核分泌型表达载体质粒pPIC9K-His-GOD是否正确,重组质粒pPIC9K-His-GOD转化大肠杆菌扩增,提取并纯化。pPIC9K-His-GOD用BlgII内切酶线性化,电激转化毕赤酵母菌GS115,以期得到高分泌易于纯化的酵母工程菌株,提取核DNA进行PCR扩增确定是否转化成功。将得到的菌种做发酵表达,SDS.PAGE检测蛋白表达。本论文取得的结果主要有：1重组质粒pPIC9K-His-GOD转化大肠杆菌：选择SacI内切酶线性化重组质粒,检测保存的酵母表达载体pPIC9K-His-GOD,将得到的目的片段载入大肠杆菌通过碱裂解法和PEG纯化方法以获得高纯度的重组质粒pPIC9K-His-GOD.2重组质粒pPIC9K-His-GOD电转化巴斯德毕赤酵母GS115:根据酵母表达体系,将纯化的重组质粒pPIC9K-His-GOD用B1g Ⅱ线性化并电激转化毕赤酵母GS115,将目的基因整合到毕赤酵母染色体上。通过基因组PCR法进行验证是否整合,确定12个菌株基因组中有GOD基因整合。利用遗传霉素G-418筛选能稳定含有GOD基因的多拷贝酵母菌株,命名为p.PIC9K-GS115-GOD04.3巴斯德毕赤酵母GS115的发酵表达：根据毕赤酵母的特点,以及转化子的培养,应用甲醇做为唯一碳源和能源做诱导表达,之前实验室保存的黑曲霉基因组的GOD序列的5’端加有编码6个组氨酸的基因序列,故发酵后上清用三氯乙酸丙酮沉淀蛋白,粗酶液采用组氨酸标签纯化,简单快捷,为了确定胞内是否有少量的目的蛋白,用超声破碎沉淀细胞,用同样的方法检测,最后用SDS-PAGE对胞内胞外蛋白进行分析。

关键词： GOD SDS-PAGE pPIC9K-His-GOD 毕赤酵母GS115 大肠杆菌dh5α

GOD转基因酵母菌的构建及其重组GOD的纯化与活性分析

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中国食品工业 2014年第5期 58-60页

作者：刘旻兰州理工大学生命科学与工程学院

葡萄糖氧化酶（GOD）被广泛应用于食品工业、医学诊断试剂等。目前葡萄糖氧化酶生产主要采用的发酵体系，大多数属于胞内表达存在生产成本偏高，且产出蛋白有杂质使产品纯度不够高等问题。因此，如何构建优良的GOD产生菌株，并让它有效... 详细信息

葡萄糖氧化酶（GOD）被广泛应用于食品工业、医学诊断试剂等。目前葡萄糖氧化酶生产主要采用的发酵体系，大多数属于胞内表达存在生产成本偏高，且产出蛋白有杂质使产品纯度不够高等问题。因此，如何构建优良的GOD产生菌株，并让它有效的高表达，具有重要意义。本实验用Sacl内切酶鉴定所保存的质粒是否正确，克隆的真核分泌型表达载体质粒pPIC9K—His—GOD转化大肠杆菌，提取重组质粒pPIC9K—His—GOD并纯化质粒。用pPIC9K—His—GOD用BlgII内切酶线性化，电转毕赤酵母菌GS115，用PCR法鉴定其基因组中是否转化成功。将得到的预期菌种做发酵表达，SDS-PAGE检测蛋白表达结果。

关键词： GOD SDS—PAGE pPIC9K—His—GOD 毕赤酵母GS115 大肠杆菌dh5α

表达于工程菌 dh5α 中 Taq DNA 聚合酶的纯化

维普期刊数据库评论

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大连轻工业学院学报 1997年第4期16卷 67-70页

作者：包永明祖国仁大连轻工业学院食品工程系

采用聚乙烯亚胺沉淀、ＢｉｏＲｅｘ７０离子交换、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、ＰＣＲ检测等简单方法，在３０ｈ内完成ＴａｑＤＮＡ聚合酶的基因重组质粒在工程菌ＤＨ５α中超表达酶的提取纯化及酶活标定。２０００ｍｌ发酵液可提纯３... 详细信息

采用聚乙烯亚胺沉淀、ＢｉｏＲｅｘ７０离子交换、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、ＰＣＲ检测等简单方法，在３０ｈ内完成ＴａｑＤＮＡ聚合酶的基因重组质粒在工程菌ＤＨ５α中超表达酶的提取纯化及酶活标定。２０００ｍｌ发酵液可提纯３万Ｕ的ＴａｑＤＮＡ聚合酶，与国外优质产品（ｐｒｏｍｅｇａ）相比，热稳定性没有差别，扩增特异性尚需进一步探讨。

关键词： Taq-DNA聚合酶纯化大肠杆菌dh5α dh5α

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漠黄梅共生菌藻宏基因组文库的构建

菌物研究 2010年第3期8卷 176-180页

作者：张杰周启明魏江春吉林农业大学中药材学院长春130118 中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室北京100101

为了从耐旱地衣漠黄梅的共生菌藻基因组中筛选功能基因,并为蛋白质类药物的基因筛选提供平台,采用改进的CTAB方法提取其总DNA,用Sau3AⅠ限制性内切酶部分酶切基因组DNA,以质粒pUC19为载体,转入大肠杆菌dh5α中,构建了漠黄梅共生菌藻的... 详细信息

为了从耐旱地衣漠黄梅的共生菌藻基因组中筛选功能基因,并为蛋白质类药物的基因筛选提供平台,采用改进的CTAB方法提取其总DNA,用Sau3AⅠ限制性内切酶部分酶切基因组DNA,以质粒pUC19为载体,转入大肠杆菌dh5α中,构建了漠黄梅共生菌藻的宏基因组文库。该文库包含了4.8×105个重组子,插入片段的平均大小为4kb,覆盖漠黄梅菌藻的整个基因组4次。

关键词：地衣 pUC19 大肠杆菌dh5α