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基因敲除提高大肠杆菌工程菌生产异丁醇产量的研究

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生物技术通报 2012年第7期28卷 170-175页

作者：郭媛林丽华郭玲庞浩彭建新黄日波广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室、国家非粮生物质能源工程技术研究中心、广西生物炼制重点实验室南宁530007

探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经... 详细信息

探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经构建的表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA,并检测该工程菌在1L发酵罐的发酵过程中的生物量、突变菌株的稳定性、异丁醇产量及有机酸含量的变化情况。成功获得pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H。发酵结果表明,该工程菌能以较长时间,较高比生长速率保持对数生长期,其稳定性较好,异丁醇产量增加了40%。成功构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H,结合非自身发酵途径使异丁醇的产量由3 g/L提升至4.2 g/L。

关键词：大肠杆菌工程菌基因敲除异丁醇非发酵途径 Red重组系统

木糖发酵生产高纯度D-乳酸大肠杆菌工程菌LHY02的构建

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中国生物工程杂志 2014年第12期34卷 91-96页

作者：鲁泓鹰何虎刘枣王永泽王金华工业发酵湖北省协同创新中心发酵工程教育部重点实验室湖北工业大学武汉430068

高效利用木糖发酵生产D-乳酸或其他生物质产品,是充分利用木质纤维素的一个关键问题。以高效利用木糖产L-乳酸的Escherichia coli WL204为出发菌株,采用RED基因置换技术将ldh L基因置换为ldh A基因,获得一株能利用木糖产D-乳酸的大肠杆... 详细信息

高效利用木糖发酵生产D-乳酸或其他生物质产品,是充分利用木质纤维素的一个关键问题。以高效利用木糖产L-乳酸的Escherichia coli WL204为出发菌株,采用RED基因置换技术将ldh L基因置换为ldh A基因,获得一株能利用木糖产D-乳酸的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli LHY02,该菌株利用10%木糖发酵,D-乳酸产量达到84.4 g/L,产物光学纯度达到99.5%。此外,该菌株仍然具有较好的利用葡萄糖产D-乳酸的能力。

关键词：木糖 D-乳酸大肠杆菌工程菌 RED基因置换技术

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

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微生物学报 2013年第4期53卷 328-337页

作者：赵锦芳许丽媛王永泽赵筱王金华湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室武汉430068 工业发酵湖北省协同创新中心武汉430068

【目的】本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(ΔfrdBCΔldhAΔackAΔfocA-pBΔpdhR::pBp6-pBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌。【方法】利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coliJH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量。【结果】工程菌JH12在15 L发酵罐中以6%的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L.h),乳酸生产强度为1.14 g/(L.h),乳酸的产量达到41.13 g/L。发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69%(L-乳酸在总发酵产物的比率)。工程菌JH12以6%的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L.h),乳酸生产强度为0.60 g/(L.h),乳酸的产量达到34.73 g/L。发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98%。【结论】本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高。本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据。

关键词：大肠杆菌工程菌 L-乳酸同源重组染色体插入五碳糖

大肠杆菌工程菌利用甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸研究

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湖北农业科学 2016年第24期55卷 6541-6545页

作者：赵锦芳薛葳蕤张晓敏王永泽王金华湖北工业大学生物工程学院/发酵工程教育部重点实验室武汉430068

大肠杆菌HBUT-L来源于HBUT-D,因此具有快速利用蔗糖的特性。对HBUT-L利用蔗糖及甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸的特性进行了研究。结果表明,该菌株在96 h的发酵过程中,可将100 g/L的蔗糖转化生成60.0 g/L乳酸,转化率达到74.0%,杂酸产量少,具有工... 详细信息

大肠杆菌HBUT-L来源于HBUT-D,因此具有快速利用蔗糖的特性。对HBUT-L利用蔗糖及甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸的特性进行了研究。结果表明,该菌株在96 h的发酵过程中,可将100 g/L的蔗糖转化生成60.0 g/L乳酸,转化率达到74.0%,杂酸产量少,具有工业化开发潜力。在玉米浆培养基中可以直接添加未经处理的甘蔗糖蜜,发酵周期持续224 h,发酵液所得乳酸产量为87.0 g/L,发酵液残糖为28.6 g/L,但乳酸产率极低,仅为0.389 g/(L·h),后续将对甘蔗糖蜜预处理工艺进行研究,进一步提高乳酸发酵速度和产量。

关键词：大肠杆菌工程菌甘蔗糖蜜发酵 L-乳酸

大肠杆菌工程菌利用玉米浆发酵产L-乳酸的研究

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中国酿造 2012年第12期31卷 64-67页

作者：李坤朋许雅洁赵锦芳王金华湖北工业大学生物工程学院发酵工程教育部重点实验室湖北武汉430068

在以玉米浆为有机氮源,葡萄糖结晶废糖液为碳源的发酵培养基上对大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了4L发酵产L-乳酸研究,确定了HBUT-L在玉米浆发酵培养基中能生长,并且可高效快速地将葡萄糖发酵转化成L-乳酸。乳酸产量达到108.3g/L,50h内发酵结... 详细信息

在以玉米浆为有机氮源,葡萄糖结晶废糖液为碳源的发酵培养基上对大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了4L发酵产L-乳酸研究,确定了HBUT-L在玉米浆发酵培养基中能生长,并且可高效快速地将葡萄糖发酵转化成L-乳酸。乳酸产量达到108.3g/L,50h内发酵结束,L-乳酸光学纯度在99%以上,糖酸转化率在97%以上,产率为2.16g(/L.h),是无机盐发酵培养基产率的79.7%。为HBUT-L利用玉米浆发酵产L-乳酸,降低生产成本及其工业化提供参考。

关键词：大肠杆菌工程菌玉米浆发酵 L-乳酸

中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响

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中国酿造 2016年第9期35卷 43-46页

作者：文瑶周玮刘枣王永泽王金华湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心湖北武汉430068

该文对前期构建的产高光学纯度L-乳酸的大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了耐乳酸钠的驯化,并对驯化前后菌株发酵产L-乳酸的中和剂进行了选择和对比。结果表明,经过28代驯化后的菌株HBUT-L16以Ca(OH)_2 作中和剂时发酵效果较Na OH为中和剂时效... 详细信息

该文对前期构建的产高光学纯度L-乳酸的大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了耐乳酸钠的驯化,并对驯化前后菌株发酵产L-乳酸的中和剂进行了选择和对比。结果表明,经过28代驯化后的菌株HBUT-L16以Ca(OH)_2 作中和剂时发酵效果较Na OH为中和剂时效果好,L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度分别提高了6.6%、5.6%、44.4%。与驯化前菌株HBUT-L的发酵结果相比,HBUT-L16以Ca(OH)_2 为中和剂进行发酵时,乳酸产量提高了4.4%,糖酸转化率提高了2.8%,生产强度增加了26.71%;而以Na OH为中和剂时,对驯化前后菌株的发酵效果影响不大,由此推测耐乳酸钠的驯化主要通过提高工程菌对乳酸根的耐受性而非钠离子的耐受性,来提高L-乳酸的产量。

关键词：大肠杆菌工程菌工广乳酸驯化中和剂

D-乳酸大肠杆菌工程菌的驯化及其补料发酵研究

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湖北农业科学 2016年第18期55卷 4771-4775页

作者：文瑶周玮付相敏赵筱王金华王永泽工业发酵湖北省协同创新中心/发酵工程教育部重点实验室/湖北工业大学生物工程与食品学院武汉430068

以前期构建的D-乳酸大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌LHY02为出发菌株,通过在乳酸盐中对菌株进行驯化的方式来解除乳酸根对菌体的抑制作用;采用葡萄糖分批补加方式缓解高含量葡萄糖的阻遏效应,拟进一步提高大肠杆菌发酵产D-乳酸的产量... 详细信息

以前期构建的D-乳酸大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌LHY02为出发菌株,通过在乳酸盐中对菌株进行驯化的方式来解除乳酸根对菌体的抑制作用;采用葡萄糖分批补加方式缓解高含量葡萄糖的阻遏效应,拟进一步提高大肠杆菌发酵产D-乳酸的产量、生产强度和糖酸转化率。结果表明,驯化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖发酵中D-乳酸产量比驯化前提高了36.7%。LHY201结合葡萄糖进行补料发酵(补料方式为8%+8%+4%),乳酸产量、发酵时间、糖酸转化率以及生产强度分别为185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h,D-乳酸光学纯度达到99.6%,相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵,乳酸产量和糖酸转化率分别提高了21.1%和21.2%,发酵周期缩短了一半。

关键词：大肠杆菌工程菌 D-乳酸驯化补料发酵

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大肠杆菌基因工程菌生产番茄红素研究

大肠杆菌基因工程菌生产番茄红素研究

作者：卢韦首都师范大学

学位级别：硕士

番茄红素是一种重要的类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，能阻止低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇的氧化，防止动脉粥样硬化和冠心病发生以及防治肺癌，膀胱癌，宫颈癌和皮肤癌等。近年来，番茄红素的制备工艺，特别是发酵法生产，受到研究... 详细信息

番茄红素是一种重要的类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，能阻止低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇的氧化，防止动脉粥样硬化和冠心病发生以及防治肺癌，膀胱癌，宫颈癌和皮肤癌等。近年来，番茄红素的制备工艺，特别是发酵法生产，受到研究人员的重视。所有类胡萝卜素均是由共同的前体异戊烯焦磷酸(IPP)合成而来的。异戊烯焦磷酸(IPP)的合成是通过典型的甲羟戊酸途径或发现不久的非甲羟戊酸途径合成的。在大肠杆菌中，IPP的生物合成是由中心代谢途径的中间产物丙酮酸和3-磷酸甘油醛(G3P)分支合成的。该研究中，我们在大肠杆菌工程菌(携带含欧文氏菌crtE，crtI和crtB基因的pACCRT-EIB质粒，该质粒有p15A复制起点，基因由自身的启动子控制)中过表达了能转化IPP为番茄红素的法尼基焦磷酸合成酶(ispA)和异戊烯焦磷酸异构酶基因(idi)，通过控制中心碳代谢促进番茄红素合成。另外，结合代谢工程策略和优化过程的实验以使番茄红素产量最大化。主要内容如下： (1)从破壁方法、浸提溶剂及提取条件等方面对大肠杆菌工程菌番茄红素提取工艺进行了优化研究。结果表明酸-热法是大肠杆菌工程菌破壁提取番茄红素的最佳方法;丙酮是理想的提取溶剂。对破壁的条件(包括破壁的温度、时间、酸的浓度及添加量等)和提取的条件(包括浸提溶剂的添加量及浸提温度、时间等)进行了分析研究。优化得到适宜的破壁和提取条件为：盐酸浓度为4mol／L、盐酸溶液用量10 mL／g(湿菌体)、破壁温度35℃、破壁时间20min、丙酮添加量20mL／g(湿菌体)、浸提温度为40℃、浸提时间为2h、浸提级数为2次。 (2)研究了碳源、无机氮源、刺激物等对工程菌生长及色素累积的影响，确定了合适的培养条件：培养基为改良LB+M9培养基(蛋白胨10g／L，酵母粉5g／L;甘油20g／L;NaHPO·7HO 12.8 g／L;CaCl 0.022 g／L;KHPO 3 g／L;NaCl 0.5 g／L;MgSO 0.48 g／L;NHCl 1 g／L;(NH)SO 10 g／L;富马酸钠2 g／L;pH 7.0。);培养温度为33℃。发酵完成后工程菌的生物量(干重)为6.48g／L，番茄红素的最高含量可达10.6mg／L。 (3)ispA，idi和ispA-idi基因的克隆和表达：法尼基焦磷酸到牻牛儿牻牛儿焦磷酸的转化是在大肠杆菌工程菌中合成类胡萝卜素的第一瓶颈，其次是异戊烯焦磷酸的异构和法尼基焦磷酸的合成。移走这些瓶颈将会提供足够的前体来合成番茄红素等类胡萝卜素。我们分别克隆了大肠杆菌DH5α异戊烯焦磷酸异构酶(由idi基因编码)基因和法尼基焦磷酸合成酶(由ispA编码)基因。两个基因以及基因连接产物分别与欧文氏菌的基因簇(crtEIB)被导入大肠杆菌以产生抗氧化的橘红色番茄红素。番茄红素产量测定结果表明，工程菌DH5α(pACCRT-EIB，pUC19-ispA-idi)单位产量和单位体积产量分别提高了68.88％、68.92％。说明，引入的idi和ispA基因能够提高原来基因工程菌的番茄红素产量。 (4)构建了基因工程菌BL21(DE3)(pACCRT-EIB，pET28a(+)-ispA-idi)，但菌生长缓慢，番茄红素产量下降。构建的重组质粒pET-28a-ispa-idi-EIB导入BL21(DE3)后，虽然能成功的合成番茄红素，但由于菌体生长受到严重影响，番茄红素产量十分低下。 (5)在摇瓶初步优化条件基础上进行了7L罐发酵实验，在更为优化的pH值、溶氧、碳氮量、溶氧量等条件下，原工程菌DH5α(pACCRT-EIB)和工程菌DH5α(pACCRT-EIB，pUC19-idi)的番茄红素体积产量分别达到20mg／L和66mg／L，单位产量与各自的摇瓶实验结果相近。

关键词：番茄红素大肠杆菌工程菌提取工艺发酵代谢工程

CGA-N46基因大肠杆菌工程菌的构建与表达

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科学技术与工程 2008年第15期8卷 4055-4059页

作者：李瑞芳薛雯雯河南工业大学生物工程学院郑州450001

嗜铬粒蛋白N端31-76位氨基酸组成的多肽CGA-N46具有很强的抑制白念珠菌活性,具有重要的研究价值。通过基因工程技术构建了能表达CGA-N46蛋白的大肠杆菌工程菌BL21(DE3,pET-N46),诱导表达后,进行SDS-PAGE及western-blotting。结果表明在I... 详细信息

嗜铬粒蛋白N端31-76位氨基酸组成的多肽CGA-N46具有很强的抑制白念珠菌活性,具有重要的研究价值。通过基因工程技术构建了能表达CGA-N46蛋白的大肠杆菌工程菌BL21(DE3,pET-N46),诱导表达后,进行SDS-PAGE及western-blotting。结果表明在IPTG诱导下,CGA-N46蛋白基因在BL21(DE3,pET-N46)中获得表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在。

关键词：嗜铬粒蛋白 CGA-N46 大肠杆菌工程菌构建表达