检索结果-南通市图书馆

作者：郝小燕南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景和目的细菌性脑膜炎是新生儿时期中枢神经系统最常见最严重的感染。在过去三十年中,发达国家和发展中国家,细菌性脑膜炎发病率一直都没有明显变化,占新生儿疾病的1‰,但死亡率达17%-38%,未死亡者遗留神经系统后遗症者也高... 详细信息

一、研究背景和目的细菌性脑膜炎是新生儿时期中枢神经系统最常见最严重的感染。在过去三十年中,发达国家和发展中国家,细菌性脑膜炎发病率一直都没有明显变化,占新生儿疾病的1‰,但死亡率达17%-38%,未死亡者遗留神经系统后遗症者也高达58%。B族链球菌和大肠埃希菌是引起新生儿细菌性脑膜炎的最常见病原体,由于对B族链球菌携带孕妇的产时预防和对新生儿的抗生素选择性治疗,所以新生儿B族链球菌感染率明显减低,但同时也降低了新生儿对非B族链球菌感染的抵抗力,致使大肠埃希菌(E.coli)k1株成为目前新生儿细菌性脑膜炎的首要致病菌。大肠埃希菌(E. coli)k1株在40%败血症或80%脑膜炎患儿中都可分离到,它主要源于母亲肠道,孕妇因其特殊体质,肠道定殖的E. coli k1株容易易位于阴道,致使新生儿在通过产道时获得感染。研究表明新生儿20%肠道中有E. coli k1株定植,其中孕妇肠道有该菌定植的占77%。E. coli k1株一旦定植于新生儿肠道,0.5%可发生肠道侵袭性定位转移而入血,并穿过血脑屏障而引发脑膜炎。随着广谱抗生素的广泛应用,耐药性大肠埃希菌不断增多,致使新生儿尤其是低出生体重、极低出生体重儿的大肠埃希菌性脑膜炎病死率逐渐增高。抗生素耐药性已成为过去十年中一个严重的公共健康问题。补充和替代抗生素治疗的药物和方法研究也越来越受到关注。目前E. coli k1株如何通过肠屏障造成中枢神经系统感染,仍不清楚,但孕妇肠道易位于阴道的E.coli k1株,因发生了易位才由机会致病菌转变为致病菌,产生了致病性,所以调节肠道微生态平衡,抑制致病菌的肠道粘附侵袭,成为在孕妇阶段预防本病发生的关键步骤,另外,在新生儿脑膜炎的发生过程中,E. coli k1株首先定植于新生儿肠道,之后才会穿透肠屏障和血脑屏障,引起菌血症和脑膜炎,所以预防E. coli k1株穿透肠上皮入血,也成为有效预防其引发菌血症和脑膜炎的关键环节。研究证实益生菌可预防和治疗多种感染性疾病,其机制主要包括：直接与致病微生物相互作用,通过替代、排斥和竞争机制抑制致病菌生长和粘附定植;调节肠道微生态,促进内环境共生稳态;通过空间位点和营养竞争等阻断其对肠黏膜诱导破坏和血行转移,发挥其抗感染作用;诱导结肠Mucin基因表达的上调,肠道黏膜表面粘蛋白的分泌增多,从而拮抗致病菌的粘附侵袭和跨细胞易位转移。如将益生菌应用于早期新生儿脑膜炎的预防,可克服广谱抗生素的诸多缺点。最近已有研究首次证明乳酸菌LGG能显著抑制E. coli kl株在新生大鼠肠道粘附与入侵从而显著降低菌血症与脑膜炎发生率。但是活菌片中益生菌如何粘附于肠黏膜,是否诱导上调粘液蛋白基因表达,和如何提高肠道微生态的稳定性,目前仍不清楚。本研究的主要目的：评价三联活菌片中的益生菌对大肠埃希菌K1株在肠上皮粘附的抑制作用和预防新生儿脑膜炎的保护作用。(1)应用SYBR Green Real-time PCR法,对小鼠肠道中的益生菌-双歧杆菌和保加利亚乳杆菌,以及致病菌-E. coli k1株,进行定量检测,观察小鼠肠道益生菌的定植和对致病菌粘附的拮抗作用。(2)对益生菌和对照组小鼠肠道菌群进行变性梯度凝胶电泳图谱(DGGE)分析,观察益生菌对肠道微生态的调节作用。(3)应用活菌计数法,对乳鼠肠道、血液和脑脊液中E. coli k1株进行定量检测,观察益生菌对E. colik1株血行转移脑膜炎的拮抗作用。(4)采用竞争性排除方法,探讨益生菌抑制E. coli k1株粘附侵袭肠上皮Lovo细胞作用。通过检测细胞培养液中乳酸脱氢酶的释放量,观察益生菌对肠上皮细胞的保护作用和E.coli k1株对细胞膜通透性的损伤作用。(5)运用RT-PCR法验证益生菌对主要粘蛋白基因MUC2表达的调节作用。益生菌能否拮抗E.coli k1株诱导的粘蛋白基因表达下降,发挥其拮抗致病菌粘附侵袭和易位作用。通过以上研究,观察活菌片中益生菌能否调节肠道微生态,初步探讨益生菌抑制致病菌的粘附、侵袭和预防血行转移入脑是否与调节肠道粘液蛋白基因表达相关。二、研究方法 1、小鼠模型观察益生菌对致病菌的粘附抑制作用提取活菌片中双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、和E. coli k1株基因组DNA,双歧杆菌、保加利亚乳杆菌引物参照文献,E. coli k1株针对IbeA基因设计引物PCR,PCR产物克隆入pMD19-T Simple Vector载体中,转化至DH-5a宿主细胞,提取质粒倍比稀释后作标准品, 将雌性BALB/c小鼠10只,用活菌片PBS稀释液灌胃,连续14天,每天取肠道标本连续观察益生菌定殖情况。根据益生菌肠道定殖时间,将雌性BALB/c小鼠40只,随机分成四组,①益生菌组(L)、②益生菌+致病菌组(L+P)、③致病菌组(P)、④对照组(N),留取各组不同时间粪便标本。抽提其细菌DNA,进行Real-time PCR反应,观察益生

关键词：益生菌大肠埃希菌K1株粘附侵袭

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益生菌抑制大肠埃希菌K1株黏附与侵袭的实验研究

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热带医学杂志 2010年第5期10卷 524-527页

作者：郝小燕赵卫曹虹龙敏张文炳彭亮黄胜和南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515

目的评价三联活菌片中的益生菌对大肠埃希菌K1株在肠上皮黏附和侵袭的抑制作用。方法将大肠埃希菌K1株与Lovo细胞共孵育,采用黏附性抑制和竞争性排除方法,检测大肠埃希菌K1株黏附侵袭于Lovo细胞的数量,并采用流式细胞术分析益生菌对大... 详细信息

目的评价三联活菌片中的益生菌对大肠埃希菌K1株在肠上皮黏附和侵袭的抑制作用。方法将大肠埃希菌K1株与Lovo细胞共孵育,采用黏附性抑制和竞争性排除方法,检测大肠埃希菌K1株黏附侵袭于Lovo细胞的数量,并采用流式细胞术分析益生菌对大肠埃希菌K1株诱导的细胞凋亡的抑制作用。将Sprague Dawley乳鼠随机分为实验组(益生菌和致病菌)与对照组(致病菌)。应用活菌计数法,对各组乳鼠肠道和血液中大肠埃希菌K1株进行定量检测,观察益生菌对大肠埃希菌K1株血行转移的拮抗作用。结果益生菌在体外能显著抑制大肠埃希菌K1株黏附侵袭于Lovo细胞(P1),其抑制作用呈剂量依赖性;益生菌能显著降低大肠埃希菌K1株诱导的细胞凋亡(P1);益生菌能显著抑制大肠埃希菌K1株的生长与血行转移,患菌血症的乳鼠数量显著降低(P1)。结论三联活菌片中益生菌能显著抑制大肠埃希菌K1株对肠上皮的黏附损伤和血行转移。

关键词：益生菌大肠埃希菌K1株黏附侵袭

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益生菌对肠道致病菌肠粘附抑制作用

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中国公共卫生 2010年第12期26卷 1516-1518页

作者：郝小燕赵卫曹虹龙敏张文炳黄胜和南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515

目的评价三联活菌片中的益生菌对大肠埃希菌K1株和肺炎克氏菌在肠上皮粘附的抑制作用。方法将40只BALB/c小鼠随机分为益生菌组、益生菌和致病菌组、致病菌组和对照组,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(SYBR Green I Real-time PCR)方法 ... 详细信息

目的评价三联活菌片中的益生菌对大肠埃希菌K1株和肺炎克氏菌在肠上皮粘附的抑制作用。方法将40只BALB/c小鼠随机分为益生菌组、益生菌和致病菌组、致病菌组和对照组,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(SYBR Green I Real-time PCR)方法 ,对各组益生菌/双歧杆菌和保加利亚乳杆菌、致病菌/大肠埃希菌K1株和肺炎克氏菌进行定量检测,观察益生菌定植及其对致病菌的拮抗作用,对益生菌组小鼠肠道菌群进行变性梯度凝胶电泳图谱(DGGE)分析。结果随益生菌服用剂量增加,在肠道定植的益生菌逐渐增加,第7 d时定植达到稳定;益生菌组双歧杆菌、保加利亚乳杆菌含量(log10N/g)分别为5.33±0.37,3.32±0.49;益生菌+致病菌组分别为5.31±0.36,3.29±0.46;均高于对照组(分别为3.98±0.23,0.00±0.00),差异有统计学意义(P1);益生菌+致病菌组的大肠埃希菌k1和肺炎克氏菌基因拷贝数(log10N/g)分别为3.85±0.41,3.39±0.32,均低于致病菌组(分别为4.79±0.48,4.28±0.37),差异有统计学意义(P1);DGGE电泳图谱分析显示,服用益生菌后小鼠肠道菌群构成一致性增加。结论活菌片中益生菌能粘附于肠粘膜,并能明显抑制致病菌粘附,可提高肠道微生态的稳定性。

关键词：益生菌大肠埃希菌K1株粘附实时荧光定量PCR 变性梯度凝胶电泳

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