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基于多重rt-pcr扩增与双链cDNA合成的A组轮状病毒全基因组测序效果比较

病毒学报 2024年第4期 716-724页

作者：黄枝妙吴冰珊林琦林卫东翁育伟福建省疾病预防控制中心福建省人兽共患病研究重点实验室福州市儿童医院

建立A组轮状病毒（Group A rotavirus, RVA）全基因组单管多重rt-pcr扩增方法，并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取，分别用单管多重... 详细信息

建立A组轮状病毒（Group A rotavirus, RVA）全基因组单管多重rt-pcr扩增方法，并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取，分别用单管多重rt-pcr扩增方法对RVA全基因组进行扩增，用随机引物对病毒核酸进行反转录及双链cDNA合成，最后采用Illumina平台对这2种不同类型的产物进行二代测序。用CLC软件对测序数据进行拼接，分析有效数据量、测序深度及全基因组覆盖度等参数，并用IGV软件查看全基因组测序深度覆盖轨迹。多重rt-pcr扩增产物测序和双链cDNA测序获得的RVA有效数据量分别为69.39%～99.83%和0.38%～92.99%，平均测序深度分别为10172×～68156×和35×～61783×，全基因组测序深度10×以上的位点覆盖度分别为98.93%～100.00%和86.28%～100.00%。从全基因组测序深度情况来看，多重rt-pcr扩增产物测序在同一个基因节段内部测序深度较为均匀，在11个节段之间测序深度差别较大；而双链cDNA测序在不同基因节段之间的测序深度较为均匀，但同一个基因节段内部靠近5'和3'末端测序深度较低。2种方法所获得的病毒核苷酸序列基本一致，部分基因节段在5'或3'末端100 bp区域内存在2个以内的核苷酸位点差异。在多重rt-pcr扩增方法中鉴于引物在不同基因型别间的特异性，对本研究中未涉及到的基因型别的扩增效率还有待进一步验证。单管多重rtpcr扩增方法和双链cDNA合成方法虽然各有优缺点，但均适用于轮状病毒全基因组二代测序在基层的推广。

关键词： A组轮状病毒全基因组测序多重rt-pcr扩增扩增子测序双链cDNA合成

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