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多重pcr—ssp技术应用于HPA-1-17bw基因分型研究和广西壮族人群HPA多态性的分布

中国输血杂志 2014年第1期27卷 8-14页

作者：申卫东李丽兰廖燕赵桐茂吴国光南宁输血医学研究所广西南宁530007 美国国立卫生研究院

目的建立应用于HPA-1—17bw基因分型的多重聚合酶链反应-序列特异性引物（pcr-ssp）技术，对广西壮族人群HPA名态性分布进行调查。方法设计多种HPA序列特异性引物的组合，在1个pcr反应体系中用时扩增多个HPA基因，根据扩增片断的有无和... 详细信息

目的建立应用于HPA-1—17bw基因分型的多重聚合酶链反应-序列特异性引物（pcr-ssp）技术，对广西壮族人群HPA名态性分布进行调查。方法设计多种HPA序列特异性引物的组合，在1个pcr反应体系中用时扩增多个HPA基因，根据扩增片断的有无和大小，指定相应的HPA基因型，并以17例国际合作研究项目提供的HPA对比DNA配组标本，以及100例已知HPA型的血小板供者的DNA标本作验证。使用验证后的技术对2659例无血缘关系的广西牡成人群展开HPA-1—17bw的基因分型和抗原多态性研究。结果建立了由16种pcr引物混合物，其中有6种多重pcr多重PER引物混合液组成的pcr—ssp反应体系，可用于HPA-1～17bw等位基因的检测。以HPA参比DNA配组标本，以及已知HPA型的供者的DNA标本的检测作验证，HPA分型结果完全一致；在2659名广西壮族人群中各HPA等位基因频率分布为：HPA—1α和-16为0．9915和0．0085，HPA．2a和．26为0．9569和0．0431，HPA-3α和-3b为0．5122和0．4878，HPA-5α和-56为0．9850和0．0150。HPA．6a和-66为0．9851和0．0149，HPA-15α和-15b为0．5256和0．4744；HPA-4、HPA-7-14bw、HPA-16—17bw只有a／a的纯合子；HPA-2—3、HPA，6船以及HPA．15均存在a／a和b／b纯合子基因型个体。结论多重pcr-ssp技术应用于HPA基因分型减少了pcr扩增反应数量，节省了人力、物力，HPA分型系统性强，可用于大量标本的HPA-1—17bw基因分型等研究和筛查工作；应用该方法研究证明广西壮族人群HPA多态性分布具有民族特征，有助于对壮族人群血小板免疫学特点的了解。

关键词：人类血小板特异性抗原(HPA) HPA基因分型多重pcr-ssp 壮族广西

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抗抗生素类药物抗体的检测与研究和稀有血型分子生物学筛查

抗抗生素类药物抗体的检测与研究和稀有血型分子生物学筛查

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作者：杨启修华东师范大学

学位级别：硕士

在临床治疗过程中使用药物,特别是使用抗菌素类药物时,机身除了会产生药物耐受之外,还有可能产生针对此种药物的抗药物抗体。当机体产生抗药物抗体之后,药物、抗药物抗体及红细胞会形成一种免疫复合物,导致机体对红细胞的破坏清除,引起... 详细信息

在临床治疗过程中使用药物,特别是使用抗菌素类药物时,机身除了会产生药物耐受之外,还有可能产生针对此种药物的抗药物抗体。当机体产生抗药物抗体之后,药物、抗药物抗体及红细胞会形成一种免疫复合物,导致机体对红细胞的破坏清除,引起免疫溶血性贫血、药物使用无效以致危及患者生命安全。虽然产生抗药物抗体的几率很低,但至今为止已报道有超过100种药物可以引发抗药物抗体的产生。随着科技的进步及医药产业的发展,越来越多的药物会投入使用。因此,建立一种有效的检测抗药物抗体的方法,对药物引发的免疫溶血性贫血的检测,病因的确定,指导用药等方面都有着重要的意义。使用药物、红细胞与患者的血浆及红细胞放散液进行血清学反应,一直作为经典的检测血液中抗药物抗体的方法。但使用药物包被的红细胞并不能充分的说明患者体内的抗药物抗体究竟是针对于药物与红细胞膜的复合结构,还是针对于药物修饰作用以后的红细胞膜结构,所以,弄清药物引发抗药物抗体产生的机制,对于定义抗药物抗体的类型有着深远的意义。本研究中选取了目前上海市各大临床医院使用频率靠前的青霉素、阿奇霉素、左氧沙星、头孢呋辛、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢拉定、头孢他啶与头孢克洛9种抗生素类药物,在特殊的缓冲体系下,构建了药物包被的RBC。使用药物包被的RBC对样本进行抗药物抗体的检测,主要针对半抗原机制的抗药物抗体与药物作用于RBC膜后引发的新的自身抗体。对181例样本(在上海市血液中心血型参比实验室进行疑难配血的样本61例,进行Coombs’试验与抗体筛查的样本51例以及在瑞金医院进行骨髓移植的样本70例)进行检测。使用荧光素标记的抗体,对头孢菌素处理的RBC进行CD55与CD59的改变情况进行检测。并以青霉素为代表药物,使用Far-Western-Blotting的方法,对药物与RBC膜蛋白的作用进行研究。通过血清学方法,使用药物包被的RBC检测181例样本,在结果中发现在疑难配血的61个样本中,发现含有特异性抗青霉素抗体的样本4例(6.56%),特异性抗头孢菌素类药物抗体1(0.16%)例,非特异性抗药物抗体2(0.33%)例;在抗体筛查与Coombs’试验的50个样本中,发现含有特异性抗青霉素抗体的样本4(8%)例;在进行骨髓移植的70个样本中,发现含有特异性抗青霉素抗体的样本1(1.43%)例;针对药物来说,在全部181个样本中,产生的针对青霉素类药物的抗体是最多的,为9例(4.97%),产生了针对头孢菌素类药物抗体1例(0.55%),而非特异性抗药物抗体为2例(1.1%)。流式细胞结果显示,使用头孢菌素处理的RBC膜上CD55与CD59的含量均有下降。Far-Western-Blotting检测结果显示与青霉素作用的RBC膜蛋白分子量在130KD以上。机体只有很低的概率会产生抗药物抗体,青霉素与RBC膜蛋白作用的结果提示药物可能作用于血型蛋白上。药物会与哪些RBC膜蛋白进行结合仍不得知。本论文另一项研究是分析中国人群中CO、YT、LU、K、DI五种稀有血型等位基因的频率。人体的红细胞上有约300种抗原物质,属于30个血型系统,每种血型系统都会有很低的几率不表达某种血型抗原。这类红细胞便会呈现出稀有血型。使用常规的血清学检测很难发现稀有血型的存在,在临床上有可能会导致输血反应的发生。对于很难用血清学方法检测出的稀有血型个体,可以使用分子生物学方法,建立起稳定的稀有血型检测体系。对输配血的个体进行稀有血型检测,最大可能降低由稀有血型引起的输血反应。根据CO、YT、LU、K、DI等血型基因的SNP位点,设计出序列特异性引物,建立稳定的扩增体系,并在一个体系中,进行多种稀有血型抗原基因的筛查。经过不断优化序列特异性引物与扩增条件,建立了稳定的稀有血型抗原基因扩增体系。在研究中总共筛查了438例样本(上海市随机样本321例,土族样本61例,侗族28例,傈僳族28例)Coa、Kpb、Yta、Lub、k、Dib、Jsb1910、Jsb2019等5个血型系统的8个抗原基因位点的筛查。经多重pcr-ssp方法检测,在所有样本中,检测出Coa阴性样本0例,Kpb阴性样本0例,Yta阴性样本0例,Lub阴性样本0例,k阴性样本0例,Dib阴性样本0例,Jsb1910阴性样本0例,Jsb2019阴性样本0例。本研究在常规对抗药物抗体筛选的基础上,进一步的对抗药物抗体产生的机理也做出了初步的研究。并使用药物代替常规标记蛋白作为桥联分子,采取Far-Western-Blotting的方法对RBC膜蛋白上的药物靶位点进行研究。通过建立药物包被的RBC检测抗药物抗体并对其进行机理性的研究,可以发现,在使用抗生素的人群中,确实有一定的几率出现抗药物抗体。RBC在与头孢菌素结合

关键词：抗药物抗体抗生素稀有血型多重pcr-ssp

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