检索结果-南通市图书馆

中国农业科学 2016年第23期49卷 4619-4627页

作者：魏霜汪天杰龙阳周广彪林春贵黄帅吴希阳汕头出入境检验检疫局暨南大学理工学院食品科学与工程系广州出入境检验检疫局湛江出入境检验检疫局

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱... 详细信息

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量pcr(multiplex enrichment quantitative pcr,ME-q pcr)方法,并含扩增内标用于指示pcr反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集pcr将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量pcr的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量pcr检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集pcr循环数(10、15和20个循环),优化ME-q pcr第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q pcr的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q pcr进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q pcr的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量pcr约1个数量级,并能有效指示pcr反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量pcr相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q pcr方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示pcr反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。

关键词：霍乱弧菌创伤弧菌副溶血弧菌溶藻弧菌扩增内标多重富集定量pcr

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