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山东医药 2022年第16期62卷 1-4页

作者：徐琳琳白琼琼张金鹏焦阳殷德辉徐州医科大学公共卫生学院环境与健康重点实验室江苏徐州221004

目的探讨多表位融合蛋白(rMEP)对动物布鲁氏菌病的诊断价值。方法选择4个布鲁氏菌外膜蛋白(OMP):OMP16、OMP2b、OMP31和BP26,用生物信息学技术预测以上蛋白的细胞表位。设计重组rMEP,以其为抗原,采用间接酶联免疫吸附试验测定159份羊和... 详细信息

目的探讨多表位融合蛋白(rMEP)对动物布鲁氏菌病的诊断价值。方法选择4个布鲁氏菌外膜蛋白(OMP):OMP16、OMP2b、OMP31和BP26,用生物信息学技术预测以上蛋白的细胞表位。设计重组rMEP,以其为抗原,采用间接酶联免疫吸附试验测定159份羊和153份牛的血清样本,用受试者工作特征(ROC)曲线评估rMEP在牛或羊布鲁氏菌病中的诊断价值,用特异性试验检测rMEP在布鲁氏菌病诊断中的特异度。结果在4个蛋白中,共预测了25个表位,利用原核表达成功表达出相对分子质量约6×10^(4)的rMEP。对159份羊血清样本的诊断显示,ROC曲线下面积为0.998,阳性和阴性诊断准确率分别为98.92%、96.97%;对153份牛血清样本的诊断显示,ROC曲线下面积为0.997,阳性和阴性诊断准确率分别为98.65%、96.20%。特异性试验证实,rMEP作为抗原与所选血清无交叉反应。结论用生物信息学技术构建的rMEP可用于诊断羊和牛的布鲁氏菌病,且特异度高。

关键词：布鲁氏菌病多表位融合蛋白布鲁氏菌外膜蛋白牛羊

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猪衣原体多表位融合蛋白的表达和免疫原性研究

猪衣原体多表位融合蛋白的表达和免疫原性研究

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作者：张林湖南农业大学

学位级别：硕士

衣原体(Chlamydia spp)是一类介于细菌与病毒之间专性细胞内寄生的原核微生物,直径约为0.2um～0.5um,具有独特的双相发育周期(biphasicdevelopment cycle),可感染人和多种动物而引起多种传染性疾病。猪衣原体作为衣原体属的一个成员,被... 详细信息

衣原体(Chlamydia spp)是一类介于细菌与病毒之间专性细胞内寄生的原核微生物,直径约为0.2um～0.5um,具有独特的双相发育周期(biphasicdevelopment cycle),可感染人和多种动物而引起多种传染性疾病。猪衣原体作为衣原体属的一个成员,被认为是我国猪衣原体病的唯一致病原,猪衣原体病带来的生殖系统和呼吸系统疾病严重影响了我国生猪养殖行业的发展。疫苗在衣原体的防控上是一个具有潜力的方向,而目前国内尚无获准上市的猪衣原体疫苗。因此需要一种安全有效的猪衣原体疫苗来预防猪衣原体病为养殖业带来的损害。本文根据猪衣原体Omp A、Pmp D、MIP三个免疫候选蛋白,通过生物信息技术对其抗原表位经进行测,成功构建了两个多表位重组蛋白。并将其重组质粒连接至大肠杆菌中表达,经纯化、变性、复性最终获得了可溶性重组蛋白。Western-blot和质谱检测表明重组蛋白序列与预测序列一致。使用复性后的蛋白与弗氏佐剂联合免疫小鼠,收集免疫前后的血清进行Western-blot和细胞因子检测。结果表明,复性后的两个重组蛋白均能刺激小鼠产生抗原特异性抗体,成功引起了小鼠的体液免疫。通过对免疫前后小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α变化的监测,发现复性后的两个蛋白均可在一定程度上引起这三种细胞因子升高,因此认为本文构建的两个多表位重组蛋白具有免疫原性,均可引起体液免疫和一定程度的细胞免疫,为后续安全有效的猪衣原体重组亚单位疫苗奠定基础。

关键词：猪衣原体多表位融合蛋白亚单位疫苗原核表达免疫原性

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多表位融合蛋白对减少梅毒抗体测定假反应性的作用

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国际检验医学杂志 2021年第2期42卷 197-201页

作者：雷雪林勇平向波杜丽枝邓湘雪刘斯琦林润培刘忠民广州医科大学附属第一医院检验科广东广州510000 广州医科大学金域检验学院广东广州510000

目的针对梅毒低流行率人群,采用多表位融合片段策略以提高苍白密螺旋体(Tp)筛查试验的特异度,减少Tp假反应性结果。方法通过原核表达系统获得包含Tp47蛋白多个优势B细胞表位的多表位融合蛋白。随后将该多表位融合蛋白作为抗原用于建立... 详细信息

目的针对梅毒低流行率人群,采用多表位融合片段策略以提高苍白密螺旋体(Tp)筛查试验的特异度,减少Tp假反应性结果。方法通过原核表达系统获得包含Tp47蛋白多个优势B细胞表位的多表位融合蛋白。随后将该多表位融合蛋白作为抗原用于建立双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法并检测96份梅毒阳性血清(1≤S/CO≤10)。将梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)结果作为标准,将多表位融合蛋白的灵敏度和特异度与Tp47蛋白进行比较。结果多表位融合蛋白双抗原夹心ELISA法检测的灵敏度和特异度分别为90.32%和94.12%,Tp47蛋白双抗原夹心ELISA法检测的灵敏度为93.55%,特异度较低,为79.41%。多表位融合蛋白双抗原夹心ELISA法与TPPA结果的符合率为91.67%,高于Tp47蛋白的88.54%。结论多表位融合蛋白可有效提高梅毒血清学诊断的特异度。该研究为开发新一代具有较高特异度的梅毒诊断方法提供了思路。

关键词： B细胞表位梅毒假反应性 Tp47蛋白酶联免疫吸附试验多表位融合蛋白

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猪肺炎支原体多表位融合蛋白的原核表达及免疫原性研究

猪肺炎支原体多表位融合蛋白的原核表达及免疫原性研究

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作者：李佳昕湖南农业大学

学位级别：硕士

猪支原体肺炎是一种慢性呼吸系统疾病,被认为是生猪生长发育迟缓的主要原因之一,对养猪业造成了严重的经济损失。目前猪场主要使用弱毒疫苗或灭活疫苗对该病进行预防,但猪肺炎支原体体外培养困难,疫苗生产成本高,且保护性有限,因此迫切... 详细信息

猪支原体肺炎是一种慢性呼吸系统疾病,被认为是生猪生长发育迟缓的主要原因之一,对养猪业造成了严重的经济损失。目前猪场主要使用弱毒疫苗或灭活疫苗对该病进行预防,但猪肺炎支原体体外培养困难,疫苗生产成本高,且保护性有限,因此迫切需要探索一种免疫性良好的新型疫苗。本研究通过生物信息学技术从猪肺炎支原体232菌株中选出了三个具有高免疫原性的抗原片段,将每个片段重复三次后用柔性连接肽首尾相连,形成一个命名为Mhp232的多表位融合基因,在大肠杆菌系统中进行表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定后对其表达形式和最佳表达条件进行探索,然后将蛋白大量表达和纯化。分别使用小鼠His-tag抗体和猪Mhp特异性血清进行Western-blot试验,验证纯化后蛋白的免疫活性。将具有免疫活性的融合蛋白用弗式佐剂乳化,在第1、8、15天时腹腔注射BALB/c小鼠。收集免疫前和免疫后第22天的小鼠血清,分别检测血清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量,评估细胞免疫水平;使用免疫后的小鼠血清进行Western-blot试验,同时建立间接ELISA方法检测小鼠的特异性Ig G抗体,评估体液免疫水平。结果显示,Mhp232多表位融合蛋白是约60k Da大小的具有免疫活性的可溶性蛋白,在IPTG终浓度为0.8 m M、15℃诱导20 h的条件下表达量最高。小鼠免疫融合蛋白22天后血清中的IFN-γ含量与免疫前相比有显著提升,分别增加了423.16 pg/m L(高剂量组)、467.74 pg/m L(中剂量组)、269.52 pg/m L(低剂量组);IL-2含量分别增加了145.16 pg/m L(高剂量组)、115.97 pg/m L(中剂量组)、14.03 pg/m L(低剂量组);TNF-α含量与免疫前相比无显著性差异,分别增加了10.04 pg/m L(高剂量组)、6.86 pg/m L(中剂量组)、12.37 pg/m L(低剂量组)。免疫后小鼠血清的Western-blot试验发生了阳性反应,用建立的间接ELISA方法检测小鼠血清,发现各免疫剂量组小鼠均产生了高水平的特异性Ig G抗体。研究结果表明,以Mhp232多表位融合蛋白为免疫原的疫苗在诱导小鼠细胞免疫与体液免疫方面均有良好的效果,为Mhp基因工程多表位疫苗的探究奠定了基础。

关键词：猪肺炎支原体多表位融合蛋白新型疫苗免疫原性

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贵州省PEDV流行株遗传演化分析及抗原表位串联表达的研究

贵州省PEDV流行株遗传演化分析及抗原表位串联表达的研究

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作者：万娟贵州大学

学位级别：硕士

猪流行腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是导致不同生长阶段猪群发生腹泻类疾病的主要病原体之一。PEDV为有囊膜的单股正链RNA冠状病毒,S基因是PEDV的主要毒力基因,S基因的插入、缺失、突变可能会导致PEDV毒力的改变,... 详细信息

猪流行腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是导致不同生长阶段猪群发生腹泻类疾病的主要病原体之一。PEDV为有囊膜的单股正链RNA冠状病毒,S基因是PEDV的主要毒力基因,S基因的插入、缺失、突变可能会导致PEDV毒力的改变,是PEDV分型的主要依据。ORF3基因与PEDV的毒力有关,编码224个氨基酸,可以用于区分疫苗和野生型PEDV,是PEDV流行病学调查的有价值工具。为了解PEDV在贵州省的感染情况、PEDV流行毒株的遗传变异情况,以及初探S基因主要抗原表位串联表达蛋白的免疫效果,本实验基于PEDV S基因保守区域设计特异性引物及探针,经优化后建立了一种Taq Man RT-q PCR检测方法,应用该方法对2017年～2023年2月贵州省内养猪场临床送检的腹泻样品进行了PEDV回溯性检测,并对部分PEDV阳性样品的S、ORF3基因进行了克隆和遗传演化分析。同时,对PEDV S蛋白的主要抗原表位进行了预测分析,设计构建了主要抗原表位的串联表达质粒,并对诱导表达纯化的重组蛋白抗原性进行了研究。具体方法结果如下:1、猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用为建立一种便捷、特异性强、灵敏度高的Taq Man RT-q PCR检测方法,了解贵州省PEDV流行情况,本研究针对PEDV S基因的保守区域设计了引物和探针,通过RT-PCR扩增并克隆目的片段构建标准质粒,经系列优化后建立了Taq Man RT-q PCR检测方法。结果显示,该方法的最优反应程序为50℃逆转录15 min;95℃30 s;95℃5 s,56℃30 s,共40个循环。该方法具有良好的线性关系,其相关系数为0.995,可靠性较高;与Po RV、TGEV、PDCo V等病毒不存在交叉反应,特异性高;最低检测限度可达1.0 copies/μL,比普通RT-PCR反应检测方法灵敏100倍。在1×10～5～1×10～3copies/μL标准品范围内,批内和批间重复变异系数均小于1.5%,具有良好的重复性和稳定性。应用该方法对2017年～2023年2月贵州省不同地区养猪场送检的119份临床样品进行PEDV回溯性检测,结果显示PEDV阳性率为77.31%（92/119）,且每年的1～4月送检的腹泻样品最多,阳性率为84.85%（56/66）。上述结果表明,贵州省PED主要在春季多发。本研究在丰富贵州省PEDV流行病学资料的同时,亦为分析贵州省PEDV S和ORF3基因的遗传演化奠定了材料基础。2、30份阳性样品的S和ORF3基因克隆与遗传演化分析为了解贵州省PEDV流行毒株的遗传变异特点,本研究针对PEDV ORF3、S基因设计了特异性扩增引物,选取30份PEDV阳性样品进行S、ORF3基因的扩增、克隆、测序,对所得序列进行遗传演化分析,并对S蛋白的B、T淋巴细胞主要抗原表位进行预测分析。结果表明:30份样品的S基因大小在4146～4170 bp,编码1382～1390 aa,ORF3基因大小均为675 bp,编码224 aa。与CV777株相比,30份样品的S基因存在52处相同氨基酸位点突变,且突变主要存在于S1-NTD区;ORF3基因存在6处相同氨基酸位点突变,相对较保守。30份样品的S基因与CV777株氨基酸同源性为93.2%～95.0%,ORF3基因与CV777株氨基酸同源性为94.2%～96.4%,同源性较低。基于PEDV S基因,30份样品在GⅠ、GⅡ型均有流行,主要流行GⅡ型,其中4份隶属于GⅠb亚型;8份隶属于GⅡa亚型,与疫苗株XJ-DB2亲缘关系较近;18份隶属于GⅡb亚型,与疫苗株AJ1102、AJ1102-R亲缘关系较近。基于ORF3基因,30份样品全部隶属于GⅡ型,其中15份隶属于GⅡb亚型,与疫苗株XJ-DB2亲缘关系较近;15份隶属于GⅡa亚型,与疫苗株AJ1102、AJ1102-R亲缘关系较近。与CV777株相比,基于PEDV S基因分型,可以把ND、TD、GC、AV作为GⅡa亚型的分子标记,把TD、FY、SG、PS、Y缺失作为GⅡb亚型的分子标记,把KN、IL、YF、YF、ND、CF、FS、AD,G缺失作为GⅡc亚型的分子标记;基于ORF3基因分型,可以把LS、IV作为GⅡa亚型的分子标记,把FV、HQ作为区分GⅡb亚型的分子标记。与CV777株S基因相比,26份GⅡ型S基因糖基化位点均存在3个位点缺失和2个位点插入,相差较大;30份样品的S基因4个中和抗原表位的突变集中在COE区,存在7～11个氨基酸突变。预测发现,PEDV S蛋白主要存在9个B淋巴细胞抗原表位和5个T淋巴细胞抗原表位。上述结果表明本研究克隆的30株PEDV均为变异株,且与经典疫苗株S基因相比,同源性、抗原表位、N

关键词：猪流行性腹泻病毒 S基因 ORF3基因遗传演化分析 TaqMan RT-PCR 多表位融合蛋白抗原性

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