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牛IL-18基因克隆、O型FMDV多表位重组体的构建、表达及其实验免疫研究

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牛IL-18基因克隆、O型FMDV多表位重组体的构建、表达及其实验免疫...

作者：张林吉林大学

学位级别：硕士

进行特异设计引物后,对牛白介素18(IL-18)基因进行了RT-PCR克隆,将克隆产物至pMD18-T载体上,筛选阳性重组质粒,测序。结果表明:克隆到的牛IL-18序列与非洲水牛IL-18核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别是99.5%和99%。为研究牛IL-18... 详细信息

进行特异设计引物后,对牛白介素18(IL-18)基因进行了RT-PCR克隆,将克隆产物至pMD18-T载体上,筛选阳性重组质粒,测序。结果表明:克隆到的牛IL-18序列与非洲水牛IL-18核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别是99.5%和99%。为研究牛IL-18的结构及生物学功能,新型疫苗佐剂开发奠定了基础。利用大肠杆菌原核表达系统,对O型FMDV多表位免疫原基因重组体mVP1进行了表达,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在,用尿素梯度法对包涵体进行洗涤,最后用切胶的方法对经洗涤过的包涵体进行了粗步纯化。表达的蛋白占菌体总蛋白的18%。Western Blot检测证实其可被抗O型FMDV多抗识别,可用于FMDV血清检测。应用生物信息学和分子设计理论,人工合成的O型FMDV多表位免疫原基因重组体mVP1克隆至真核表达载体pVAX1上,构建DNA疫苗pVAX1-mVP1。辅以超抗原SEA和牛IL-18构建了含内原性佐剂DNA疫苗pVAX1-SEA-mVP1和pIRES-IL18-mVP1。将构建的DNA疫苗与两种化学佐剂混合后分别单独免疫BalB/C小鼠和联合免疫BalB/C小鼠,并对其诱导的体液和细胞免疫水平进行了检测。结果表明,上述3种DNA疫苗均能诱导免疫动物产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以化学佐剂2与pIRES-IL18-mVP1组免疫效果最佳。本研究结果为新型疫苗研发提供了新思路。

关键词：口蹄疫病毒序列分析多表位基因表达免疫应答

诺如病毒多表位抗原基因的表达及多克隆抗体制备

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诺如病毒多表位抗原基因的表达及多克隆抗体制备

作者：李志凯集美大学

学位级别：硕士

诺如病毒是引起人类非细菌性胃肠炎的主要病原之一，可导致严重的公共卫生问题。诺如病毒具有很高的传染性和变异性，可以使各年龄段的人引发急性胃肠炎，尤其在抵抗力弱的人群中有很高的发病率，因此快速、尽早地确诊对预防和控制诺如... 详细信息

诺如病毒是引起人类非细菌性胃肠炎的主要病原之一，可导致严重的公共卫生问题。诺如病毒具有很高的传染性和变异性，可以使各年龄段的人引发急性胃肠炎，尤其在抵抗力弱的人群中有很高的发病率，因此快速、尽早地确诊对预防和控制诺如病毒的传播是非常重要的。近年来对诺如病毒的研究，多是采用表达全长ORF2所编码的衣壳蛋白，制备单克隆抗体，再通过ELISA等方法进行检测，其对单一基因型诺如病毒的检测无疑是准确的，却无法同时确定多个基因型别的样品，这限制了其在检测中的应用。多表位抗原基因是运用重组DNA技术将多个编码抗原表位的核苷酸片段串连组合起来构成，其在HIV、CSFV和结核杆菌等方面的研究已经取得突破性进展，然而目前对诺如病毒多表位抗原基因的研究还未见报道。本论文通过化学合成、PCR扩增和酶切连接相结合的方法将4段S区表位序列进行串联，在原核表达系统中诱导表达得到重组融合蛋白;用纯化得到的重组融合蛋白免疫兔子，获得兔抗NoV多克隆抗体;利用制备的兔抗NoV多克隆抗体包被磁珠，获得免疫磁珠，应用免疫磁珠对诺如病毒颗粒进行富集研究，得到以下结果： (1)根据已经发表文献中表位信息，选择诺如病毒衣壳蛋白靠近N端S区的3个表位，通过化学合成的方法得到NoV多表位抗原基因前段基因片段A;结合本实验室前期的研究内容和NCBI中提供的序列信息，根据S区设计引物，以编号1004株诺如病毒cDNA为模板，扩增得到NoV多表位抗原基因后段基因片段B;将A和B连接起来构建了诺如病毒多表位抗原基因，核苷酸长438bp，共编码145个氨基酸，并将其与表达质粒pET-32a(+)连接，转化到BL21（DE3）中进行原核表达，得到34kDa的重组融合蛋白。30°C诱导6h后，经SDS-PAGE分析，目的蛋白占全菌总蛋白的35%左右，并且大部分为可溶性蛋白，利用亲和层析方法纯化得到重组融合蛋白。 (2)将纯化得到的重组融合蛋白浓缩后加入免疫佐剂免疫兔子，经5次免疫后，心脏采血获得抗血清，用辛酸-硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体，间接ELISA法测定抗体效价为1:51200。 (3)将兔抗NoV多克隆抗体包被磁珠，对磁珠与抗体偶联条件进行优化，优化后的条件为：最佳包被介质为PBS，最佳pH为7.4，最佳包被时间为3h，最佳包被温度为20°C，最佳抗体浓度为300μg/mL。用制备的免疫磁珠对肛拭子中诺如病毒进行富集研究，提取富集前后的病毒RNA，并用实时荧光定量PCR方法检测，结果表明富集后的诺如病毒检测结果均为阳性，免疫磁珠对GI、GII型诺如病毒都有吸附效果，制备的多克隆抗体能很好的与诺如病毒颗粒产生特异性结合。

关键词：诺如病毒多表位基因克隆表达抗体制备免疫磁珠

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乙型肝炎多表位DNA疫苗的发展趋势

生命的化学 2006年第1期26卷 41-44页

作者：陶嫦立曹以诚华南理工大学生物科学与工程学院广州510640

乙型肝炎多表位DNA疫苗(epitopeDNAvaccine,minigenes/epigenes)是指多个表位(包括T细胞、B细胞等表位)经过优化组合,以能产生高效的细胞、体液免疫应答进而清除HBV病毒为目的而得到的新型乙肝疫苗。该文介绍近年来国内外在乙型肝炎多表... 详细信息

乙型肝炎多表位DNA疫苗(epitopeDNAvaccine,minigenes/epigenes)是指多个表位(包括T细胞、B细胞等表位)经过优化组合,以能产生高效的细胞、体液免疫应答进而清除HBV病毒为目的而得到的新型乙肝疫苗。该文介绍近年来国内外在乙型肝炎多表位DNA疫苗方面的发展趋势。

关键词：乙型肝炎多表位基因 DNA疫苗

HIV多表位核酸疫苗免疫实验及鸡痘病毒转移载体的构建研究

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HIV多表位核酸疫苗免疫实验及鸡痘病毒转移载体的构建研究

作者：李臻吉林大学

学位级别：硕士

本研究利用已经设计并人工合成的多表位基因,以HIV-1巨分子颗粒p24为支架,连入安全的真核表达载体质粒pVAX1,构建了新型HIV多表位重组DNA疫苗(pVAX1-MEGN-p24),细胞转染结果表明,pVAX1-MEGN-p24成功地表达了MEGNp24抗原蛋白。将该重组... 详细信息

本研究利用已经设计并人工合成的多表位基因,以HIV-1巨分子颗粒p24为支架,连入安全的真核表达载体质粒pVAX1,构建了新型HIV多表位重组DNA疫苗(pVAX1-MEGN-p24),细胞转染结果表明,pVAX1-MEGN-p24成功地表达了MEGNp24抗原蛋白。将该重组质粒免疫小鼠,实验结果显示,该重组质粒能够诱导免疫小鼠产生针对HIV细胞免疫和体液免疫,并且以细胞免疫为主。佐剂重组核酸疫苗组具有稳定的特异性CTL反应作用。本研究还构建了新型鸡痘病毒转移载体,并利用该载体获得了一株含HIV多表位基因的重组鸡痘病毒株,运用RT-PCR和IFA方法检测了外源基因重组及鸡痘病毒在鸡胚成纤维细胞中的表达状况。实验结果显示,外源基因已正确重组入鸡痘病毒基因组,且可在鸡胚成纤维细胞中进行有效表达。

关键词： HIV 多表位基因核酸疫苗鸡痘病毒转移载体重组鸡痘病毒

流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的构建与细胞转染研究

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西部医学 2015年第2期27卷 182-185,189页

作者：寇静远潘兴李婉宜邝玉周琳琳杨靖石新丽陆顺顺黄筱钧邓昭敏秦臻王保宁李明远四川大学华西基础医学与法医学院微生物教研室四川成都610041 湖北医药学院微生物学教研室湖北十堰442000

目的设计并构建含分子内佐剂的流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg,初步研究其在HEK293T细胞中的转染效率。方法通过生物信息学软件设计并合成了含分子内佐剂的流感病毒多表位基因CTB-Eg,将其插入真核载体pEGFP-C2中,获得了重组质粒pEGFP-C2/... 详细信息

目的设计并构建含分子内佐剂的流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg,初步研究其在HEK293T细胞中的转染效率。方法通过生物信息学软件设计并合成了含分子内佐剂的流感病毒多表位基因CTB-Eg,将其插入真核载体pEGFP-C2中,获得了重组质粒pEGFP-C2/CTB-Eg;用脂质体法转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察和PCR法检测其转染效率。结果成功构建了真核表达质粒pEGFP-C2/CTB-Eg,且该重组质粒能在HEK293T细胞中瞬时转染,转染效率在50%～70%之间。结论本研究成功设计、构建了CTB-Eg融合基因,其在HEK293T细胞中转染效率较高,为流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg在小鼠体内的抗病毒作用研究奠定了坚实基础。

关键词：流感病毒核酸疫苗多表位基因霍乱毒素B亚单位

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丙型肝炎

传染病网络动态 2008年第2期 111-114页

聚乙二醇干扰素α-2b联用利巴韦林治疗慢性丙型肝炎的临床安全性研究；丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性;DC-SIGNR基因多态性与丙型肝炎病毒载量的相关性研究;精氨酸酶Ⅰ在HCV转染肝癌细胞增殖中的作用;丙型肝炎病毒N... 详细信息

聚乙二醇干扰素α-2b联用利巴韦林治疗慢性丙型肝炎的临床安全性研究；丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性;DC-SIGNR基因多态性与丙型肝炎病毒载量的相关性研究;精氨酸酶Ⅰ在HCV转染肝癌细胞增殖中的作用;丙型肝炎病毒NS4B对p53表达及细胞凋亡的影响.

关键词：慢性丙型肝炎聚乙二醇干扰素α-2b DC-SIGNR 丙型肝炎病毒肝癌细胞增殖临床安全性多表位基因基因多态性