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恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

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科学技术与工程 2012年第22期20卷 5438-5441,5446页

作者：沈燕赵亚黄豫晓梁姣刘忠湘李英辉第四军医大学微生物学与病原生物学教研室西安710032

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗... 详细信息

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。

关键词：恶性疟原虫疫苗多表位基因

日本脑炎病毒多表位基因与法氏囊活性肽的串联表达及其免疫特性研究

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日本脑炎病毒多表位基因与法氏囊活性肽的串联表达及其免疫特性研...

作者：刘泉南京农业大学

学位级别：硕士

日本脑炎(Japanese Encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。猪作为日本脑炎传播的中间扩增宿主,带毒蚊子通... 详细信息

日本脑炎(Japanese Encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。猪作为日本脑炎传播的中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病在我国流行面积较大,对养猪业的危害巨大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。目前对乙型脑炎的治疗仍然没有行之有效的方法,而且对待本病主要还是以免疫接种疫苗的方式进行预防。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展,作为理想的免疫原,抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位,才能诱导出高特异性的细胞及体液免疫应答,从细胞免疫和体液免疫水平起到预防或治疗作用,赋予较广泛的保护性。因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。法氏囊(bursa of Fabricus, BF)是禽类独有的中枢免疫器官,其功能与哺乳动物中的骨髓类似。三肽囊素作为BF组织中分离的活性分子,无种属特异性,不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。法氏囊五肽为BF组织中分离的又一活性分子,对禽类具有明显的免疫调节功能。本研究利用基因重组技术,把日本脑炎病毒E蛋白上的多表位基因(MEP)、囊素样肽基因和法氏囊五肽基因分别串联起来,构建三种原核表达载体,在大肠杆菌表达系统中表达。表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,研究三者的免疫原性及保护效力,希望为研制具有高免疫原性的改良的乙脑表位疫苗提供依据。具体的研究内容如下： 1串联表达JEV E蛋白多表位基因、囊素样肽及法氏囊五肽利用PCR扩增出含日本脑炎病毒(JEV)E蛋白6个B细胞表位(氨基酸残基分别位于75-92,149-163,258-285,356-362,373-399,397-403),2个T细胞表位的基因(氨基酸残基分别位于60-68和436-445),即JEV E蛋白多表位基因(MEP),用EcoRl和Xhol双酶切将其连接到pET-28a(+)载体中,构建含MEP基因的重组原核表达载体。由于囊素样肽(Bur sin-like peptide, BSA)能增强乙脑亚单位疫苗的免疫反应,在本研究中还构建了一个在大肠杆菌中表达的重组载体,将JEV E蛋白多表位基因(MEP)按正确的读码框与囊素样肽基因串联,构建含MEP-BSA基因的重组原核表达载体。此外,法氏囊五肽(Bursopentine, BP5)为本组从鸡法氏囊中新分离的一种活性肽,为了弄清其免疫佐剂效应,本研究将JEV E蛋白多表位基因(MEP)、囊素样肽基因按正确的读码框与法氏囊五肽基因串联,构建另一个融合表达载体pET-MEP-BSA-BP5。将三种重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,以His-Bind螯合层析柱纯化三种融合蛋白(rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5),然后运用SDS-PAGE进行可溶性分析,利用Western Blotting对该融合蛋白进行了鉴定。结果表明：三种融合蛋白均以包涵体的形式获得了高效表达。通过His-Bind螯合层析柱纯化后的三种融合蛋白,通过Western Blotting鉴定其具有良好的抗原性。 2重组蛋白rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5对小鼠特异性免疫的影响 4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。将50μg的rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白(用100μl PBS稀释)分别以肌肉注射接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别是PBS和JEV弱毒疫苗(SA-14-14-2病毒株)。通过检测中和抗体、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-y和IL-4细胞因子的表达水平、T细胞亚型、攻毒实验发现,使用rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白都能明显的提高小鼠的特异性免疫反应。IgG1和细胞因子IL-4水平表明rMEP蛋白主要刺激Th2型免疫反应。而rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5蛋白既能刺激Th2型免疫反应,也能刺激Thl型免疫反应。然而,Thl型免疫反应明显低于JEV弱毒疫苗但高于rMep蛋白,rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5两个蛋白产生的免疫反应很相似。攻毒实验结果表明]MEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5与弱毒苗一样都能保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,且保护率均为100%,证明rMEP、rMEP-BSA、rMEP-

关键词：日本脑炎病毒多表位基因囊素样肽法氏囊五肽融合蛋白疫苗

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

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中国动物传染病学报 2010年第2期18卷 41-46页

作者：李艳陈兆国聂奎米荣升西南大学动物科技学院重庆400714 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室中国农业科学院动物源性食品安全研究中心上海200241

应用多个服务器对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8+细胞毒性T细胞(CD8+cytotoxic Tlymphocyte,CD8+CTL)表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高... 详细信息

应用多个服务器对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8+细胞毒性T细胞(CD8+cytotoxic Tlymphocyte,CD8+CTL)表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-28a(+)-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55.3%,纯化的重组蛋白纯度达75.1%。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下基础。

关键词：微小隐孢子虫表位预测多表位基因原核表达抗原性

弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫免疫检测中的应用

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热带医学杂志 2007年第9期7卷 853-855页

作者：杨培梁李华周晓红彭鸿娟吴焜陈晓光南方医科大学南方医院实验动物研究中心广州510515 南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系广州510515

目的评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景。方法以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓形虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板... 详细信息

目的评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景。方法以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓形虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板,分别检测弓形虫急性和慢性感染血清,评价试剂盒检测的敏感性和特异性。结果经Ni-NTAAgarose和割胶纯化,得到了纯度为95.86%的弓形虫多表位重组可溶性抗原。以3!g/ml的抗原浓度包被ELISA微孔板,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测。结果检测小鼠血清141份,其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%。检测兔血清24份,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%,总一致性为91.5%。结论以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景。

关键词：弓形虫多表位基因重组抗原免疫诊断 ELISA试剂盒

P.f多期多表位基因真核表达载体的构建和免疫学特性初步研究

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中国医药科学 2013年第10期3卷 26-27,30页

作者：刘文文王军刘学武赵亚沈燕姜河李英辉第四军医大学航空航天医学系学员五队陕西西安710032 第四军医大学微生物学与病原生物学教研室陕西西安710032

目的构建恶性疟原虫多期多表位基因的真核表达载体及其免疫学特性的研究。方法在前期研究基础上,将测序正确的恶性疟原虫多期多表位基因克隆入真核表达载体VR1020内并大量制备。以VR1020重组质粒免疫HHD-2小鼠并进行细胞和体液免疫分析... 详细信息

目的构建恶性疟原虫多期多表位基因的真核表达载体及其免疫学特性的研究。方法在前期研究基础上,将测序正确的恶性疟原虫多期多表位基因克隆入真核表达载体VR1020内并大量制备。以VR1020重组质粒免疫HHD-2小鼠并进行细胞和体液免疫分析。结果成功获得重组真核表达载体,ELISA显示该重组质粒免疫小鼠后获得了较高效价的抗体,而且显示了较好的CTL杀伤活性,同时诱导了高水平的细胞因子。结论本研究为新型疟疾疫苗的研制奠定一定的理论和实践基础。

关键词：恶性疟原虫疫苗多表位基因

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弓形虫多表位基因对番茄的转化研究

弓形虫多表位基因对番茄的转化研究

中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会

作者：周晓红胡建军李林王和勇陈晓光广州第一军医大学寄生虫学教研室广州第一军医大学学员一旅五队广州第一军医大学学员一旅五队广州中山大学生命科学学院广州第一军医大学寄生虫学教研室

＜正＞目的:获得弓形虫多表位基因转基因番茄植株。方法:1.用番茄果实特异性E8启动子驱动弓形虫多表位抗原基因构建植物表达载体pCE2MG,酶切鉴定。2.用液氮冻融法将pCE2M6转化根癌农杆菌LBA4404,PCR鉴定。3.用农杆菌介导的T-DNA转化法... 详细信息

＜正＞目的:获得弓形虫多表位基因转基因番茄植株。方法:1.用番茄果实特异性E8启动子驱动弓形虫多表位抗原基因构建植物表达载体pCE2MG,酶切鉴定。2.用液氮冻融法将pCE2M6转化根癌农杆菌LBA4404,PCR鉴定。3.用农杆菌介导的T-DNA转化法转化番茄子叶和下胚轴,用卡那霉素对番茄转化子进行抗性筛选,在芽诱导

关键词：弓形虫多表位基因克隆表达

禽冠状病毒IBV多表位基因重组乳酸菌表达载体构建和鉴定

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禽冠状病毒IBV多表位基因重组乳酸菌表达载体构建和鉴定

四川省动物学会第九次会员代表大会暨第十届学术研讨会

作者：曹海鹏王红宁张毅樊汶樵张安云郭自成丁梦蝶四川大学生命科学学院动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室生物资源与生态环境教育部重点实验室"985工程"西南资源环境与灾害防治科技创新平台

目的:获得IBV多表位肽表达量高、有生物活性、能分泌到胞外或通过锚定肽在细胞壁上的重组乳酸菌,并以此为活载体疫苗口服施喂鸡群,筛选出免疫效果好的重组乳酸菌,为下一步关于乳酸菌活载体疫苗研究奠定基础。方法:将本实验室构建好的IB... 详细信息

目的:获得IBV多表位肽表达量高、有生物活性、能分泌到胞外或通过锚定肽在细胞壁上的重组乳酸菌,并以此为活载体疫苗口服施喂鸡群,筛选出免疫效果好的重组乳酸菌,为下一步关于乳酸菌活载体疫苗研究奠定基础。方法:将本实验室构建好的IBV多表位基因AN插入pNZ8149(Nco I酶切位点之后),电转化乳酸菌NZ3900构建基因AN的乳酸菌胞内表达体NZ3900/pNZ8149-AN;将乳酸菌外源蛋白分泌表达信号肽基因SPusp45与AN连接,再使用同样方法插入质粒pNZ8149中并通过电转构建分泌型重组乳酸菌NZ3900/pNZ8149-SP-AN;将分泌增强子九肽(Leisstcda)基因通过分子生物学方法连接在信号肽基因与AN基因之间,采用同样方法插入pNZ8149并转化乳酸菌,构建增强分泌型重组乳酸菌NZ3900/pNZ8149-SP-LEISS-AN;将金黄色葡萄球菌的细胞壁锚定蛋白SPA的碳末端基因Cspa使用菌落PCR扩增的方法扩增出来,连接在分泌型重组质粒pNZ8149-SP-AN的后端构建锚定型外源基因表达体NZ3900/pNZ8149-SP-AN-Cspa。所有重组菌通过对目的基因的PCR扩增、重组质粒的双酶切、DNA测序鉴定与相应目的序列一致,重组菌体外培养并使用抗菌肽Nisin诱导,离心分离上清和沉淀分别制备蛋白样品SDS-PAGE鉴定表明,IBV多表位基因AN在所有重组菌内都得到了表达,并且分泌表达体的产量明显高于胞内表达体。结论:本实验室构建了BV多表位基因AN重组乳酸菌不同形式的表达体:NZ3900/pNZ8149-AN、NZ3900/pNZ8149-SP-AN、NZ3900/pNZ8149-SP-LEISS-AN、

关键词：禽冠状病毒IBV 多表位基因分泌表达乳酸菌NZ3900 锚定

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弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

中国动物学会第七届全国青年寄生虫学工作者学术讨论会

作者：周晓红陈晓光张晓东杨培梁王亚楠李林习佳飞胡建军广州第一军医大学寄生虫学教研室广州第一军医大学寄生虫学教研室北京市农林科学院生物技术研究中心广州第一军医大学寄生虫学教研室第一军医大学学员一旅五队第一军医大学学员一旅五队第一军医大学学员一旅五队第一军医大学学员一旅五队

＜正＞目的:将含弓形虫两期（速殖子和缓殖子）的多个保护性抗原表位的编码基因即弓形虫多表位基因（TGMG）,用不同的启动子驱动,构建弓形虫多表位基因植物表达载体。方法:①首先将弓形虫多表位基因亚克隆进pBAC55载体,构建中间载体pB... 详细信息

＜正＞目的:将含弓形虫两期（速殖子和缓殖子）的多个保护性抗原表位的编码基因即弓形虫多表位基因（TGMG）,用不同的启动子驱动,构建弓形虫多表位基因植物表达载体。方法:①首先将弓形虫多表位基因亚克隆进pBAC55载体,构建中间载体pBAC55TGMG,其以含双增强子的花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S组成型的启动子（E35S）驱动弓形虫多表位基因,3’端携带胭脂碱合成酶基因终止子（NOS3’）

关键词：弓形虫多表位基因番茄果实特异性启动子植物表达载体

HCV CTL多表位基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

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HCV CTL多表位基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

中华医学会第四次全国艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全国热带病学术会议

作者：郝晓娟李端陈丽萍马力赵甫涛赵英仁贾战生西安第四军医大学唐都医院全军感染诊疗中心

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合CTL多表位基因的真核表达载体,转染体外培养的COS-7细胞,观察HCV CTL多表位基因在真核细胞中的表达及定位。方法根据生物信息学方法筛选的HCV多个CTL优势表位,合成复合多表位抗原基因(mcf);将其克隆入带... 详细信息

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合CTL多表位基因的真核表达载体,转染体外培养的COS-7细胞,观察HCV CTL多表位基因在真核细胞中的表达及定位。方法根据生物信息学方法筛选的HCV多个CTL优势表位,合成复合多表位抗原基因(mcf);将其克隆入带有绿色荧光蛋白标签的真核

关键词： HCV CTL CTL 多表位基因 COS-7 真核表达载体