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抗菌肽LL37慢病毒复合体转染多能诱导干细胞的体外实验研究

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抗菌肽LL37慢病毒复合体转染多能诱导干细胞的体外实验研究

作者：王继鹏青岛大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过构建pGC-FU-LL37-GFP慢病毒表达载体,转染多能诱导干细胞,在实现目的基因LL37稳定表达的前提下,验证其在组织工程中的促血管生成作用,并诱导iPSCs细胞分化为尿路上皮细胞,达到在体外获取种子细胞的目的。方法:（1）目的... 详细信息

目的:本研究通过构建pGC-FU-LL37-GFP慢病毒表达载体,转染多能诱导干细胞,在实现目的基因LL37稳定表达的前提下,验证其在组织工程中的促血管生成作用,并诱导iPSCs细胞分化为尿路上皮细胞,达到在体外获取种子细胞的目的。方法:（1）目的基因LL37的提取;（2）pGC-FU-LL37-GFP慢病毒表达载体的构建及测序鉴定;（3）pGC-FU-LL37-GFP慢病毒表达载体对小鼠多能诱导干细胞的转染及鉴定;（4）通过细胞计数实验、细胞迁移实验、血管成形实验证实转染后的iPSCs细胞的促血管生成能力;（5）诱导染后的iPSCs细胞向尿路上皮细胞分化,并鉴定分化后的细胞。实验结果应用GraphPad Prism 8软件绘制统计结果图,应用IBM SPSS 25.0统计分析软件进行数据处理。结果:（1）qPCR结果证实慢病毒表达载体pGC-FU-LL37-GFP构建成功,并且测序结果与目标序列完全一致;（2）在转染后的iPSCs细胞内,目的基因LL37融合了GFP共同表达;（3）qPCR检测iPSCs细胞内目的基因LL37 m RNA表达量较对照组提高（P＜0.01）;（4）Elisa测定iPSCs细胞及细胞上清液,抗菌肽LL37的表达量较对照组提高（P＜0.05）;（5）细胞计数实验证明转染后的iPSCs细胞可促进HUVECs细胞增殖;（6）与对照组相比,实验组细胞划痕距离明显缩短（P＜0.01）,证明iPSCs细胞分泌的抗菌肽LL37可促进HUVECs细胞迁移;（7）与对照组相比,实验组血管腔分支点明显增多（P＜0.01）,证明转染后的iPSCs细胞上清液可加速HUVECs成管化进程;（8）分化后的iPSCs细胞形态呈铺路石样,具有明显的上皮样特性,qPCR及western blot鉴定分化后的iPSCs细胞,尿路上皮细胞标志物表达上调。结论:（1）iPSCs细胞转染pGC-FU-LL37后能够表达分泌抗菌肽LL37;（2）抗菌肽LL37转染iPSCs细胞能促进血管内皮细胞增殖、迁移以及血管生成;（3）抗菌肽LL37转染iPSCs细胞能够成功分化为尿路上皮细胞。意义:本研究为培养具有促血管生成作用的种子细胞提供了理论基础。

关键词：多能诱导干细胞抗菌肽LL37 分化尿路上皮细胞血管成形

来源于Alport综合症多能诱导干细胞转录组基因差异性表达

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中国热带医学 2017年第7期17卷 668-674页

作者：刘汉勇马华林深圳市人民医院肾脏内科广东深圳518106

目的探讨来源于Alport综合症患者尿肾状杆细胞诱导分化的多能诱导干细胞差异性表达转录组基因。方法通过高通量测序平台,寻找来源于Alport综合症患者与正常者有意义差异性表达转录组基因,差异性表达的转录组基因借助功能注释软件对其参... 详细信息

目的探讨来源于Alport综合症患者尿肾状杆细胞诱导分化的多能诱导干细胞差异性表达转录组基因。方法通过高通量测序平台,寻找来源于Alport综合症患者与正常者有意义差异性表达转录组基因,差异性表达的转录组基因借助功能注释软件对其参与生物过程进行基因GO富集与KEGG信号同路分析。结果在Alport患者与正常者中分别找到26 021 874、27 551 343高质量转录组。其中,1 168个转录组基因在Alport与正常者存在有意义差异性表达,其中包括86个上调表达基因与382个下调表达基因。基因富集分析发现41个基因富集项目,包括9个细胞组成项目,2个基因分子功能项目,30个生物学过程项目。差异性表达转录组基因主要富集在细胞膜、膜系统;主要参与MAPK信号通路。结论 Alport综合症与正常者转录组基因存在差异性表达,这些差异性表达转录组基因影响细胞生物学功能,对其深入研究有助于解释Alprot发病机制、诊断与治疗。

关键词： Alport综合症转录组多能诱导干细胞

单中心Alport综合征患儿临床资料分析及一例COL4A5基因突变患儿多能干细胞的诱导

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单中心Alport综合征患儿临床资料分析及一例COL4A5基因突变患儿多...

作者：冯卫东宁夏医科大学

学位级别：硕士

第一部分单中心Alport综合征患儿临床资料分析目的分析COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突变在不同性别患儿中临床疾病特点。方法收集2016年3月至2019年12月在广州市妇女儿童医疗中心就诊并确诊的45名Alport综合征患儿。按照不同性别、不同... 详细信息

第一部分单中心Alport综合征患儿临床资料分析目的分析COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突变在不同性别患儿中临床疾病特点。方法收集2016年3月至2019年12月在广州市妇女儿童医疗中心就诊并确诊的45名Alport综合征患儿。按照不同性别、不同突变基因、不同病理类型等进行分组,统计分析患儿性别、确诊年龄、肾功能、治疗情况。结果本次共收集了45例Alport综合征(AS)患儿,对其进行统计分析:(1)其中男性患儿共31例(68.89%),女性患儿共14例(31.11%),男女比例为2.21:1;(2)男性患儿确诊时平均年龄6.25±3.62岁,女性患儿确诊时平均年龄5.61±3.21岁,差异无统计学意义(P>0.05);COL4A5突变基因组中,患儿确诊平均年龄为5.43±2.96岁,COL4A4突变基因组中,患儿平均年龄为10.38±3.47岁。COL4A3突变基因组患儿平均年龄4.47±2.02岁,各组间差异有统计学意义(P细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)建立hi PS(人来源多能诱导干细胞)细胞株,为Alport综合征疾病体外模型提供实验基础。方法首先从患儿外周血中分离出单核细胞,将其在PBMC培养液中进行培养,再将OCT4、SOX2、MYC、KLF4、BCL-XL五种转录因子利用质粒导入培养的细胞内,对细胞进行重编程,使其去分化,随后对其进行疾病突变验证、碱性磷酸酯酶染色(AP染色)、细胞核型分析、RT-q PCR检测多能性基因表达、细胞免疫荧光检测、三胚层定向分化实验、整合分析实验、支原体检测。结果通过PBMC细胞诱导成的干细胞呈现出胚胎干细胞(ES)样克隆形状。对其进行多能性验证,发现诱导成的干细胞碱性磷酸酯酶染色阳性,细胞SOX2,OCT4,NANOG,LIN28和REX1多能性基因表达阳性,三胚层定向分化实验表明其具有分化成为三个不同胚层的潜能。整合分析实验及支原体检测表明建系的hi PS细胞没有外源质粒载体整合及支原体感染。疾病突变验证证明建系的i PS细胞携带COL4A5:NM00495.4:c.1517-1G>T突变(半合子)。结论利用体细胞建立Alport综合征干细胞疾病模型,是开展Alport综合征研究的有力实验支撑,为进一步明确该疾病发生机制和药物筛选创造了研究平台。

关键词： Alport综合征基因诊断肾活检多能诱导干细胞质粒载体多能性基因

人源诱导多能干细胞体外定向分化为功能性肝细胞的方法研究

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现代生物医学进展 2023年第2期23卷 225-231页

作者：邵文桂张阳阮海文窦金辉张雪峰赵树立中国药科大学南京市第一医院江苏南京201106 江苏鼎泰药物研究股份有限公司江苏南京211800

目的:研究开发一种简易、快速在体外使多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)定向分化为功能性肝样细胞的培养方法。方法:根据正常肝细胞在体内的发育规律,设计简化诱导方法使i PS细胞定向分化为内胚层细胞,应用qPCR... 详细信息

目的:研究开发一种简易、快速在体外使多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)定向分化为功能性肝样细胞的培养方法。方法:根据正常肝细胞在体内的发育规律,设计简化诱导方法使i PS细胞定向分化为内胚层细胞,应用qPCR和流式细胞术鉴定其纯度后进一步诱导分化为肝样细胞,并通过qPCR、ELISA、免疫荧光等技术鉴定肝细胞的性状和功能。结果:i PS细胞诱导7天后,OCT4和NANOG的表达水平显著下降,内胚层细胞相关基因CXCR4、FOXA2和HNF4A表达水平明显升高。内胚层细胞继续诱导培养15天后,肝细胞特异性标志基因ALB、TDO2、RBP4、G6PC和肝药酶基因CYPs等显著上调,同时产生高水平的白蛋白和尿素;PAS糖原染色为阳性,能主动摄取和释放吲哚菁绿,证实诱导成的肝样细胞具备正常肝细胞的部分功能。结论:该诱导方案能够在体外使i PS细胞遵循正常肝脏发育通路简易、高效地分化为功能性肝细胞。本研究为大量获得iPS来源的肝细胞及其在细胞疗法和药筛模型中的运用提供了可能性。

关键词：多能诱导干细胞内胚层定向分化肝细胞药筛模型

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诱导多能干细胞在骨关节炎治疗中的应用进展

国际骨科学杂志 2023年第5期44卷 318-320,331页

作者：张运恒王轩李毅陕西中医药大学第二临床医学院陕西咸阳712046 西安交通大学医学院附属红会医院足踝外科陕西西安710054

骨关节炎(OA)是一种常见的慢性关节疾病,以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特点,主要影响老年人,引起关节疼痛、僵硬等症状,严重者可发生关节畸形甚至残疾。目前OA治疗多以疼痛管理和关节置换为主,不能达到修复受损软骨或恢复组织... 详细信息

骨关节炎(OA)是一种常见的慢性关节疾病,以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特点,主要影响老年人,引起关节疼痛、僵硬等症状,严重者可发生关节畸形甚至残疾。目前OA治疗多以疼痛管理和关节置换为主,不能达到修复受损软骨或恢复组织稳态的目的。诱导多能干细胞(iPSC)具有很强的向软骨细胞分化的潜能,且具有可通过对体细胞重编程获得、来源较多、不涉及伦理问题等特点。iPSC的出现为软骨修复提供了新的途径,并有望在OA早期治疗中发挥重要作用。该文就iPSC在OA治疗中的应用进展进行综述。

关键词：骨关节炎多能诱导干细胞重编程软骨再生

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干细胞治疗迟发性性腺功能减退症的研究进展

临床泌尿外科杂志 2023年第4期38卷 310-314页

作者：赵伟刘春山西医科大学第一医院泌尿外科太原030000

迟发性性腺功能减退症(LOH)是困扰中老年男性的常见疾病。目前的睾酮替代疗法存在各种弊端。近年来,随着再生医学研究的不断发展,干细胞治疗越来越成为研究热点。本文主要介绍以诱导多能干细胞(iPSCs)、睾丸间质干细胞(SLCs)和间充质干... 详细信息

迟发性性腺功能减退症(LOH)是困扰中老年男性的常见疾病。目前的睾酮替代疗法存在各种弊端。近年来,随着再生医学研究的不断发展,干细胞治疗越来越成为研究热点。本文主要介绍以诱导多能干细胞(iPSCs)、睾丸间质干细胞(SLCs)和间充质干细胞(MSCs)为来源的干细胞治疗LOH的研究进展,重点比较各方案的不同及其产生细胞的有效性和安全性。目前关于干细胞治疗仍处于早期研究阶段,治疗的安全性、免疫排斥等问题仍有待解决。相信随着研究的进展,以MSCs为代表的干细胞将在LOH治疗中发挥重要作用。

关键词：多能诱导干细胞间充质干细胞睾丸间质干细胞睾丸间质细胞睾酮

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尿源干细胞研究进展

国际儿科学杂志 2021年第7期48卷 445-449页

作者：杜宣瑾(综述) 沈茜(审校) 复旦大学附属儿科医院肾脏科上海市肾脏发育和儿童肾脏病研究中心201102

尿源干细胞(urine-derived stem cell,USC)是指从尿液中获取的一类间充质干细胞,因其提取简便快捷、获取途径无创、不存在伦理问题,在临床研究中相对于其他干细胞具有较多优势,从而备受学术界的关注。该文从尿源干细胞分离培养、细胞表... 详细信息

尿源干细胞(urine-derived stem cell,USC)是指从尿液中获取的一类间充质干细胞,因其提取简便快捷、获取途径无创、不存在伦理问题,在临床研究中相对于其他干细胞具有较多优势,从而备受学术界的关注。该文从尿源干细胞分离培养、细胞表征、来源、应用和外泌体方面对近年的研究进展做一综述。

关键词：尿源干细胞多能诱导干细胞外泌体

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成纤维细胞向运动神经元的分化研究进展

中国比较医学杂志 2018年第9期28卷 110-114,125页

作者：施玉婷李峰首都医科大学2013级长学制临床医学(儿科医学方向) 首都医科大学附属北京儿童医院北京100013 首都医科大学神经生物学系北京脑重大疾病研究院北京神经再生修复研究重点实验室北京100069

脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症等运动神经元损伤性疾病,目前尚无有效的治疗手段。随着多能诱导干细胞的出现和细胞重编程技术的发展,将患者来源的成熟体细胞体外分化得到运动神经元进行自体移植成为一种充满希望的治疗途径。此外... 详细信息

脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症等运动神经元损伤性疾病,目前尚无有效的治疗手段。随着多能诱导干细胞的出现和细胞重编程技术的发展,将患者来源的成熟体细胞体外分化得到运动神经元进行自体移植成为一种充满希望的治疗途径。此外,分化得到的运动神经元还可作为细胞模型,用于疾病的机制研究和药物筛选。目前由成纤维细胞体外分化得到运动神经元的实验研究较多,就经多能诱导干细胞或神经干细胞中间状态及直接转化这三类方法进行综述。

关键词：运动神经元成纤维细胞分化细胞重编程多能诱导干细胞

改性氨基葡萄糖化合物诱导MSCs/iPSCs成软骨细胞的生物学评价

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改性氨基葡萄糖化合物诱导MSCs/iPSCs成软骨细胞的生物学评价

作者：夏欢华南理工大学

学位级别：硕士

氨基葡萄糖（Glucosamine，GA）是健康关节软骨的天然组织成份，是软骨基质中合成蛋白聚糖必需的重要元素。其酰化衍生物也是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有许多重要生理功能。利用组织工程学方法对软骨缺损进... 详细信息

氨基葡萄糖（Glucosamine，GA）是健康关节软骨的天然组织成份，是软骨基质中合成蛋白聚糖必需的重要元素。其酰化衍生物也是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有许多重要生理功能。利用组织工程学方法对软骨缺损进行修复逐渐成为治疗软骨相关疾病的有效手段。随着GA及其衍生物在软骨组织工程中研究的深入，对GA及其衍生物诱导组织工程种子细胞成软骨细胞的能力及其影响机制的探讨也越来越成为软骨组织工程研究的热点。本研究首先对GA进行改性得到N-丙烯酰氨基葡萄糖（N-acryloyl-glucosamine，AGA），再将其与原料氨基葡萄糖盐酸盐（Glucosaminehydrochloride，GAH）及另一GA衍生物-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-glucosamine，***）分别同时诱导人间充质干细胞（human Mesenchymal Stem Cells，hMSCs）向软骨细胞分化，并从软骨细胞的增殖和形态、软骨细胞外基质的分泌、软骨特异性基因的表达三个方面比较这三种GA化合物诱导能力的大小，以期对GA及其衍生物诱导hMSCs成软骨细胞的效用做以初步研究和比较。本论文通过用丙烯酰氯对GAH进行化学改性，并调节合成反应原料中丙酮与水的比例得到纯度较高的合成产物AGA（产率为32%），省去了传统合成方法的过柱提纯步骤，优化了AGA的合成工艺条件。用分别添加不同质量的GAH、***、AGA的诱导培养基诱导hMSCs成软骨细胞，进行生物相容性评价和成软骨细胞能力的鉴定。细胞增殖毒性检测（Water-Soluble Tetrazolium，WST）和Live&dead死活细胞染色结果一致表明hMSCs在三种氨糖培养基中生长粘附良好，均能正常增殖，且hMSCs增殖程度和细胞形态与添加氨糖的不同摩尔浓度有剂量依赖性关系;添加GAH高浓度（≥5mM）时会对hMSCs细胞产生较大毒性，从而导致诱导培养过程中细胞的死亡;添加***对hMSCs细胞形态影响较大，随着诱导培养时间的增加，hMSCs细胞会向肥大型细胞形态发展;添加AGA不仅能够保证hMSCs细胞的有效增殖，且能保持诱导过程中hMSCs细胞自身长梭型的细胞形态。在成软骨诱导液中培养7天后，对三种氨糖组别分别进行基因表达水平和免疫组织学水平的检测。聚合酶链式反应（Polymerasechain reaction，PCR）和阿利新蓝及Collagen II染色阳性结果表明三种GA化合物均能在一定程度上促进MSCs细胞向软骨细胞的分化和表达，软骨细胞外基质的分泌和软骨特异性基因（Sox9、Collagen II和Aggrecan）的表达与添加氨糖的不同摩尔浓度也存在剂量依赖性关系;其中AGA组三个基因的表达水平都超过其他两组，充分证实AGA诱导hMSCs分化为软骨细胞的有效性;成软骨细胞诱导实验结果还表明添加TGF--β3（Transforming growth factor beta3）组别的hMSCs细胞增值速度较快，细胞形态变化较小，添加的TGF--β3能够促进宿主细胞基质中Collagen II和Aggrecan的表达，有助于软骨细胞的形成，且这种作用在AGA诱导的情况下表现更加明显，说明AGA与TGF-β3协同作用对诱导hMSCs成软骨细胞具有显著的促进作用。多能诱导干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）是目前被广泛应用的一类干细胞，它不仅在一定程度上解决了胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）和MSCs在医学上的伦理道德问题，而且克服了二者不同基因背景的缺陷，可作为组织工程的优异种子细胞来源。本研究通过在培养基内添加表皮细胞生长因子(epidermalgrowth factor, EGF)，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, bFGF）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factorAB，PDGF AB）三种生长因子诱导hiPSCs得到hMSCs作为种子细胞，并将其直接进行成软骨细胞诱导，通过检测宿主细胞Sox9、Collagen II和Aggrecan基因水平的表达对iPSCs的成软骨细胞能力进行初步研究。结果表明iPSCs细胞成软骨细胞诱导结果与hMSCs细胞成软骨细胞诱导结果相比，具有更高的Collagen II和Aggrecan表达，证实iPSCs细胞有较好的向软骨细胞分化的潜能，为临床找到一种新的软骨组织工程用种子细胞提供了一定的参考。

关键词： N-丙烯酰胺基葡萄糖软骨分化骨髓间充质干细胞 TGF--β3 多能诱导干细胞