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驴新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鉴定和功能分析

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驴新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鉴定和功能分析

作者：路则宽河北师范大学

学位级别：硕士

在此项研究中,为鉴定新型Cathelicidin抗微生物肽,我们以家畜驴为研究对象,构建了驴肺脏cDNA文库;使用半巢式PCR的方法,从该cDNA文库中克隆得到两种新型Cathelicidin家族抗微生物肽:Ea-CATH1和Ea-CATH2。它们分别由25(KRRGSVTTRYQFLMIHL... 详细信息

在此项研究中,为鉴定新型Cathelicidin抗微生物肽,我们以家畜驴为研究对象,构建了驴肺脏cDNA文库;使用半巢式PCR的方法,从该cDNA文库中克隆得到两种新型Cathelicidin家族抗微生物肽:Ea-CATH1和Ea-CATH2。它们分别由25(KRRGSVTTRYQFLMIHLLRPKKLFA)和26(KGRGSETTRYQFVPVHFFPWNKLS DF)个氨基酸残基组成,与目前已鉴定的其它物种内源性Cathelicidin抗微生物肽相比,没有序列同源性。它们均是碱性多肽,分别含有7个和4个碱性氨基酸残基;两者的分子量均很小,分别为3060.75 Da和3144.54 Da。在所筛选的32株细菌和真菌中,化学合成的EA-CATH1小肽对大部分菌株均有很强的杀菌活性,尤其是临床分离的耐药性菌株;Ea-CATH1对其中革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度(MIC)大多在0.3-2.4μg/ml范围内。Ea-CATH1的抗菌活性在人血清中表现相当稳定,与血清在37℃孵育3天后,仍能发挥较强的抗菌能力;而且在高达20μg/ml的剂量下(远高于对应的MIC),Ea-CATH1对人血红细胞仅显示极微弱的溶血性(1.8%)。圆二色谱显示,Ea-CATH1在模拟生物膜结构的50%TFE/ H2O溶液中主要呈现α-螺旋结构,但是在水溶液中主要采用无规则卷曲结构。在体外,0.6μg/ml的Ea-CATH1可以在2小时内彻底杀死106CFU/ml的金黄色葡萄球菌(ATCC2592),远胜于传统抗生素氨苄青霉素。利用扫描电子显微镜(SEM)观察经Ea-CATH1处理半小时的金黄色葡萄球菌(ATCC2592),结果证明Ea-CATH1能迅速破坏细菌的细胞壁和细胞膜,从而导致细胞裂解,细菌死亡;这或许是由杀菌动力学数据揭示的Ea-CATH1杀菌速度比传统抗生素快很多的原因。在CaCl2存在的条件下,Ea-CATH1表现明显的红细胞凝集活性,说明它可能抑制细菌分泌的多聚蛋白与宿主红细胞表面相互作用,从而限制细菌的繁殖和传播。在生理pH值附近的磷酸盐缓冲液(PBS)中,20μg/ml的Ea-CATH1表现较高的肥大细胞脱颗粒活性,说明它可能还是一种免疫效应分子,在宿主防御系统中介导重要的免疫反应。以上诸多特征和活性证明,Ea-CATH1很有希望成为一种先导化合物,并设计开发出新型抗微生物药物。

关键词： Cathelicidin 驴功能基因克隆多肽鉴定

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菲律宾蛤仔酶解物中活性多肽鉴定及产品开发

菲律宾蛤仔酶解物中活性多肽鉴定及产品开发

作者：于越大连工业大学

学位级别：硕士

菲律宾蛤仔是我国主要的养殖贝类之一,其分布广泛,且营养丰富,具有多种营养保健功能,但关于菲律宾蛤仔中活性多肽研究及高附加值产品开发还鲜有报道。本课题利用条件温和,安全性高的酶解法制备生物活性肽,不仅结合肽组学策略,生物信息... 详细信息

菲律宾蛤仔是我国主要的养殖贝类之一,其分布广泛,且营养丰富,具有多种营养保健功能,但关于菲律宾蛤仔中活性多肽研究及高附加值产品开发还鲜有报道。本课题利用条件温和,安全性高的酶解法制备生物活性肽,不仅结合肽组学策略,生物信息学及分子对接技术研究了酶解物中的多肽信息,还对酶解物的基本特性及生理活性进行了测定,全面解析了菲律宾蛤仔的酶解产物,主要实验内容及结论如下。首先用胰蛋白酶,中性蛋白酶及胃蛋白酶将菲律宾蛤仔可食部分进行水解,通过水解度的测定,游离氨基酸组成分析,分子量分布分析和滋味特性分析,综合考虑各项指标确定中性蛋白酶为制备菲律宾蛤仔酶解产物最优工具酶。其次利用UPLC-Q-TOF-MS/MS分离结合数据库匹配对三种酶解物进行多肽鉴定,并基于生物信息学对多肽进行致敏性预测。其中胰蛋白酶酶解物中鉴定到的多肽数量最多,为966条;三种酶解物中均鉴定到可能具有致敏性的多肽。利用分子对接技术分别筛选出三条具有ACE抑制活性的多肽,分别为TVGCRDGR,AGDDAPRA,VVDNGSGM,三条多肽与ACE酶的结合能均高于已知具有高活性的ACE活性多肽,且与ACE酶相互作用力稳定。最后用化学法测定了三种酶解物的抗氧化活性及ACE抑制活性,得出中性蛋白酶酶解物抗氧化活性最高,胃蛋白酶酶解物ACE抑制活性最高。分别用真空冷冻干燥法及喷雾干燥法将三种酶解物制备成粉并研究了两种干燥方式对所得产物色度,氨基酸组成,溶解度,起泡性和呈味特性的影响。两种干燥方式对酶解产物的色度影响差别不大,喷雾干燥后的酶解产物粒度显著小于冷冻干燥后的产物,游离氨基酸含量显著高于喷雾干燥后产物,而冷冻干燥后产物蛋白溶解度和起泡性更高;干燥方式对酶解产物风味影响较大。本课题对于菲律宾蛤仔酶解物特性的分析及多肽信息分析,为菲律宾蛤仔的活性多肽的研究及高附加值产品开发提供了理论基础。

关键词：菲律宾蛤仔酶解多肽鉴定抗氧化活性 ACE抑制活性产品开发

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用于串联质谱鉴定多肽的计量方法

生物化学与生物物理学报 2003年第8期35卷 734-740页

作者：盛泉虎汤海旭解涛王连水丁达夫中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室加州大学圣地亚哥分校计算科学与工程系加州大学系统生物学研究所中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031 圣地亚哥92093 华盛顿98103

目前已有多种对串联质谱与数据库中多肽的理论质谱的一致性进行评估的高通量计量算法用于鸟枪法蛋白质组学 (shotgunproteomics)研究。然而这些方法操作时存在大量错误的多肽鉴定。这里提出一种新的串联质谱识别多肽序列的计量算法。该... 详细信息

目前已有多种对串联质谱与数据库中多肽的理论质谱的一致性进行评估的高通量计量算法用于鸟枪法蛋白质组学 (shotgunproteomics)研究。然而这些方法操作时存在大量错误的多肽鉴定。这里提出一种新的串联质谱识别多肽序列的计量算法。该算法综合考虑了串联质谱中不同离子出现的概率、多肽的酶切位点数、理论离子与实验离子的匹配程度和匹配模式。对大容量的串联质谱数据集的测试表明 ,根据算法开发的软件PepSearch比目前最常用的软件SEQUEST有更好的鉴定准确性。PepSearch可从http : *** projects pepsearch下载。

关键词：蛋白质组信息学数据库搜索多肽鉴定概率模型串联质谱

质谱图聚类网络法在鉴定多肽翻译后修饰中的应用及研究进展

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生物工程学报 2018年第10期34卷 1567-1578页

作者：何明敏舒坤贤白明泽许睿重庆邮电大学生物信息学院大数据生物智能重庆市重点实验室重庆400065

蛋白质组学多肽鉴定方法一直以基于质谱分析和数据库搜索的方法为主,随着质谱仪技术的发展,海量的质谱数据被获取,这为大规模蛋白质的鉴定提供了一个强大的数据仓库,使得以质谱数据为基础的蛋白质组学研究成为主流。传统的串联质谱图搜... 详细信息

蛋白质组学多肽鉴定方法一直以基于质谱分析和数据库搜索的方法为主,随着质谱仪技术的发展,海量的质谱数据被获取,这为大规模蛋白质的鉴定提供了一个强大的数据仓库,使得以质谱数据为基础的蛋白质组学研究成为主流。传统的串联质谱图搜库方法鉴定多肽翻译后修饰时具有诸多局限,质谱网络方法可以在一定程度上弥补局限。文中系统综述了基于质谱聚类的质谱网络和质谱图库搜索方法的发展历程、理论研究和应用研究,讨论了质谱网络库方法在鉴定多肽翻译后修饰的优势,并进行了分析和展望。

关键词：质谱网络翻译后修饰多肽鉴定质谱库

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色谱保留时间在蛋白质组研究中的应用

色谱 2010年第2期28卷 128-134页

作者：邵晨高友鹤中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院生理和病理生理学系北京100005

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术是蛋白质组学研究中的常见方法。保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中。在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提... 详细信息

液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术是蛋白质组学研究中的常见方法。保留时间作为独立于质谱信息的参数已经被用于蛋白质的鉴定和定量工作中。在多肽鉴定领域,多肽的色谱保留时间预测与常规的二级串联质谱数据库搜索算法结合可以提高鉴定的可信度。鉴定的灵敏度也可以通过匹配多次LC-MS实验中具有相同精确质量数和保留时间的峰而提高。另一方面,由于色谱条件的微小改变即会引起保留时间的变化,因此对多次实验结果进行保留时间比对是进行非标记定量的不可或缺的步骤。另外,联合保留时间偏移和质量数信息还可以进行蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)的鉴定。

关键词：液相色谱-串联质谱保留时间预测保留时间比对多肽鉴定非标记定量翻译后修饰蛋白质组学

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陇西腊肉加工过程中蛋白质降解规律的研究

食品与发酵工业 2024年第1期50卷 204-210页

作者：陈敬敬师希雄范小宁包晓明陈骋郭兆斌甘肃农业大学食品科学与工程学院甘肃兰州730070

为明确陇西腊肉加工过程中蛋白质的降解规律,该文以猪后腿肉为研究对象,分别从原料肉、腌制中期、腌制末期、晾晒中期和成品5个加工阶段进行取样,测定腊肉加工过程中总氮、非蛋白氮、蛋白质降解指数、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TC... 详细信息

为明确陇西腊肉加工过程中蛋白质的降解规律,该文以猪后腿肉为研究对象,分别从原料肉、腌制中期、腌制末期、晾晒中期和成品5个加工阶段进行取样,测定腊肉加工过程中总氮、非蛋白氮、蛋白质降解指数、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-可溶性肽、多肽和游离氨基酸的变化情况。结果表明,陇西腊肉加工过程中,总氮含量先稍降低后显著增加,非蛋白氮含量和蛋白质降解指数显著增加(P鉴定发现,总肽段数的变化呈先上升后下降的趋势,腊肉降解产生的多肽主要来源于肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌钙蛋白和肌动蛋白。另外,陇西腊肉加工过程中总游离氨基酸含量显著增加(P多肽主要来源于肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白,蛋白质的降解可为风味物质的形成提供理论依据。

关键词：陇西腊肉加工过程蛋白质降解多肽鉴定

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肽组学分析技术及其在食品研究中的应用进展

现代食品科技 2023年第8期39卷 352-359页

作者：范丽琪郁晓艺刘磊李武许思盈李晓敏徐巨才五邑大学生物科技与大健康学院江门市大健康国际创新研究院广东江门529020 完美(广东)日用品有限公司广东中山528400

肽组学作为蛋白质组学的一门衍生科学,重点关注样品中多肽的组成及变化规律,是当前食源性多肽分析研究的热点之一。近年来,肽组学分析技术进展迅速,在食源性活性多肽的制备分析、纯化鉴定、质量控制等方面发挥了重要作用,并从分子层面... 详细信息

肽组学作为蛋白质组学的一门衍生科学,重点关注样品中多肽的组成及变化规律,是当前食源性多肽分析研究的热点之一。近年来,肽组学分析技术进展迅速,在食源性活性多肽的制备分析、纯化鉴定、质量控制等方面发挥了重要作用,并从分子层面上为揭示食源性蛋白质酶解调控机制、多肽释放特性等提供了重要的理论与技术支持。该研究主要综述了肽组学分析技术在样品前处理、色谱分离、质谱检测、结构鉴定以及生物活性评价等方面的研究进展,并对其在食源性多肽序列分析、引导制备、质量控制、活性预测和挖掘等方面的应用作了简要介绍,以期为肽组学分析技术的发展及其在食品研究中的进一步应用提供研究方向和理论参考。未来,基于多肽组学研究食品中活性肽的释放机制及作用机理将为多肽产业的进一步发展起到重要推动作用。

关键词：肽组学活性肽多肽鉴定质谱技术研究进展

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驼血蛋白胰脂肪酶抑制肽的分离纯化及鉴定

食品科技 2021年第5期46卷 128-136页

作者：孙茹欣吉日木图伊丽内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010018 内蒙古骆驼研究院内蒙古阿拉善750306

高血脂是心脑血管疾病发病的危险诱因,预防及治疗该病十分重要。食源性生物活性肽作为小分子生物活性物质,天然无毒且副作用小,逐渐成为合成类药物的替代品。文章利用风味蛋白酶对驼血蛋白进行酶解,基于前期单因素试验所得的结果,对驼... 详细信息

高血脂是心脑血管疾病发病的危险诱因,预防及治疗该病十分重要。食源性生物活性肽作为小分子生物活性物质,天然无毒且副作用小,逐渐成为合成类药物的替代品。文章利用风味蛋白酶对驼血蛋白进行酶解,基于前期单因素试验所得的结果,对驼血蛋白胰脂肪酶抑制肽的制备工艺进行优化,并对所得多肽进行分离纯化,对其胰脂肪酶抑制活性、分子质量分布、肽段序列及结合位点进行研究。结果表明:在风味蛋白酶的用量为3%、酶解时间3 h、酶解温度65 ℃、酶解pH7.5的最佳工艺条件下,酶解驼血蛋白获得的多肽具有良好的胰脂肪酶抑制活性。多肽序列分析显示共鉴定出801种肽段,其中PFF和FPHF为具有显著胰脂肪酶抑制作用的肽段。可以得出:驼血蛋白可以成为功能性食品或保健品中控制高血脂有效成分的潜在来源,研究结果为后期驼血蛋白胰脂肪酶抑制肽类保健食品的开发提供了参考依据。

关键词：驼血蛋白风味蛋白酶胰脂肪酶抑制多肽鉴定

螺旋藻抗真菌肽的分离纯化及其对柑橘腐败真菌的抑制活性研究

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螺旋藻抗真菌肽的分离纯化及其对柑橘腐败真菌的抑制活性研究

作者：颜志秀北京林业大学

学位级别：硕士

柑橘采后在贮藏、运输和销售的过程中极易因为机械损伤而引起病原微生物侵染,造成严重的资源浪费和经济损失,况且大多数侵染的病原微生物能够产生毒素,引起食品安全问题,危害人类的健康。天然防腐剂与传统化学防腐剂相比,尤其是天然抑... 详细信息

柑橘采后在贮藏、运输和销售的过程中极易因为机械损伤而引起病原微生物侵染,造成严重的资源浪费和经济损失,况且大多数侵染的病原微生物能够产生毒素,引起食品安全问题,危害人类的健康。天然防腐剂与传统化学防腐剂相比,尤其是天然抑菌肽由于其广谱抗菌性、不易产生耐药性以及安全无毒等优点成为食品防腐、医疗保健等行业的研究热点。螺旋藻由于生长速度快、生物量大以及含有丰富的蛋白质等优点,成为生物活性肽提取分离的优质来源。本项研究以螺旋藻干粉为原料,通过酶解的方法制备螺旋藻多肽,并分离纯化抗柑橘腐败真菌的多肽组分,并对其进行分析和鉴定,主要研究结果如下:（1）从不同发病症状的柑橘中分离出五种不同的腐败真菌,通过传统形态学观察和rDNA-ITS序列分析相结合的方法确定这五种腐败真菌菌株分别为指状青霉Penicillium digitatum、扩展青霉 Penicillium expansum、光抱青霉 Penicillium glabrum、深绿木霉Trichoderma atroviride和黄曲霉Aspergillus flavus。（2）以螺旋藻干粉为原料,采用反复冻融和超声破碎相结合的方法进行螺旋藻蛋白的提取。通过甲醛滴定法、茚三酮比色法、邻苯二甲醛法和三氯乙酸沉淀法四种不同水解度测定方法的比较,确定选用邻苯二甲醛法进行螺旋藻蛋白酶解液水解度的测定。通过单酶解和双酶解水解度的对比发现,采用先碱性蛋白酶后木瓜蛋白酶的双酶解方法能够提高螺旋藻酶解液的水解度,即高达42.19%;通过L9（34）正交试验确定了碱性蛋白酶的最优条件是温度55℃,pH 8.5,酶与底物比（E/S）3%时,水解度为38.97%;木瓜蛋白酶的最优条件是温度65℃,pH 5.5,E/S 5%,水解度为32.01%。与此同时,本实验还确定了胃蛋白酶的最优条件是温度40℃,pH 1.5,E/S 5%时,水解度为24.54%;胰蛋白酶的最优条件是温度45℃,pH 6.5,E/S 3%,水解度为26.08%,可以将其应用于其他蛋白酶解的研究中。（3）螺旋藻酶解液经超滤获得＜3KD、3-5KD、5-10KD和＞10KD四个不同分子段多肽组,对意大利青霉菌、指状青霉、深绿木霉和黄曲霉的抗真菌活性表现为多肽组分分子量越小,抗真菌活性越强,即＜3KD分子段的多肽组分表现出最强的抗真菌活性。选择＜3KD的多肽组分进行葡聚糖Sephadex G-25柱层析分离纯化,洗脱条件是:上样体积为2mL,流速为1mL/min,检测波长为280nm,洗脱液为0.O1mol/mLTris-Hcl缓冲溶液,层析柱柱参数为1.6×40cm。按照出峰顺序进行洗脱液的收集,共收集到两个峰,分别命名为组分A和组分B。以意大利青霉菌、指状青霉、深绿木霉和黄曲霉为供试菌,结果表明,组分B表现出较强的抗真菌活性,其对这四种供试菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为6.25、3.13、12.50和12.50mg/mL。（4）采用串联质谱LC-MS/MS对螺旋藻抗真菌肽组分B进行一级结构测定,通过uniprot蛋白数据库检索确定了四个能够找到已被鉴定且可信度高的蛋白质来源的唯一肽段,分别为 RGQGGICY、AKALTEETG、KPTPLCTEFVA 和 SVAVGVGKM,这四个唯一肽段在螺旋藻抗真菌多肽组分B发挥抗真菌活性时均起到了一定的作用。最后,根据C-藻蓝蛋白的生理活性以及抗菌肽发挥抗菌作用所具备的典型结构特征确定了螺旋藻抗真菌多肽组分B中起主要抗真菌活性作用的多肽为SP-4,分子量为629.40Da,氨基酸序列为SVAVGVGKM,对应C-藻蓝蛋白β亚基N端第126-135个氨基酸残基,该结果为后续研究和应用奠定了重要的基础。

关键词：柑橘腐败真菌螺旋藻多肽分离纯化抗真菌活性多肽鉴定