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作者：原剑中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

在蛋白质组学研究的很长时间内,天然多肽被视为体内代谢的生物垃圾。最近几年很多研究者发现,多肽作为蛋白代谢产物,反映了体内生物代谢过程。多肽组是疾病标志物的重要的宝库,对于肿瘤的早期预警、早期诊断具有重要的研究意义。肝癌作... 详细信息

在蛋白质组学研究的很长时间内,天然多肽被视为体内代谢的生物垃圾。最近几年很多研究者发现,多肽作为蛋白代谢产物,反映了体内生物代谢过程。多肽组是疾病标志物的重要的宝库,对于肿瘤的早期预警、早期诊断具有重要的研究意义。肝癌作为世界范围内高发病率疾病,引起众多研究者的关注,其在亚洲,具有与乙肝、肝硬化等密切联系的疾病特点,因此肝癌的早期预警技术研究对于预防肝癌、预测肝癌的发病趋势具有特殊的研究价值和社会意义。目前,用于临床确诊的肝癌标志物主要还是甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)、鳞状细胞癌抗原免疫球蛋白M复合物(SCCA-IgM IC)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)及其他联检标志物,最常用的AFP诊断方法对于直径3cm以下的肿瘤具有诊断局限性。因此急需开展新的标志物的研究,以适应肝癌的早期诊断研究。本论文建立了一种免疫质谱检测多肽标志物的方法,同时将该方法应用于肝癌患者血清多肽的检测分析。首先我们采用传统的单克隆抗体制备方法制备出2种多肽单克隆抗体:抗SP0104抗体、抗SP0105抗体,在此基础上使用Protein G Agarose建立了基于多肽抗体和MALDI-TOF-MS的免疫质谱方法,使用该方法对两种多肽标准品SP0104、SP0105进行检测,偏差小于0.5Da。本文进一步优化了影响免疫质谱方法灵敏度和通量的条件,确定优化结果抗体/载体量比为3.9μg/μL,抗体与载体联接采用非交联方式、抗体孵育环境4℃旋转、抗体孵育时间15分钟、抗原孵育时间8小时、洗脱液含0.1%TFA的70%ACN、洗脱时间1分钟。通过优化以上影响抗体固定和抗原检测的关键因素,提高了免疫质谱方法检测通量及灵敏度。本文分别对所建立优化后的免疫质谱方法的线性范围、准确性、重复性、冻融稳定性进行方法评价,其中在0.1pmol.4pmol范围内线性关系良好,检测限0.1pmol,线性方程为I=601.5N-79.3,相关系数为0.9642。我们分别将0.3pmol、0.9 pmol、2.7pmol标准品注入空白血清,回收率为117.6%、81.6%、125%,平行检测三次,RSD分别为26.3%、5.4%、25.6%。将0.9 pmol标准品注入空白血清,经三次冻融偏差幅度为7.3%9.2%,显示3次冻融检测结果具有稳定性。评价结果表明,优化后的免疫质谱方法适用于血清低浓度多肽的检测。最后我们比较了有机溶剂沉淀、超滤、去除IgG和白蛋白、解离白蛋白连接的多肽等4种血清多肽预处理方法和不处理对免疫质谱检测结果的影响,结果表明不处理时标志物检测值最高。采用通过优化的免疫质谱方法完成对20例正常血清、20例肝癌血清的检测,结果两组质谱峰强度检测值经过t检验,P多肽血清标志物的诊断研究。

关键词：免疫质谱多肽标志物肝癌血清

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多肽ELISA方法建立及其在肝癌早期诊断相关研究中的初步应用

多肽ELISA方法建立及其在肝癌早期诊断相关研究中的初步应用

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作者：周晓明安徽医科大学

学位级别：硕士

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是世界上各种实体肿瘤中预后效果较差的恶性肿瘤之一，并具有与乙肝、肝硬化等密切联系的疾病特点。因此，癌症的早期预警技术研究对于预防肝癌、预测肝癌的发病趋势具有非常重要的研究价值和社会... 详细信息

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是世界上各种实体肿瘤中预后效果较差的恶性肿瘤之一，并具有与乙肝、肝硬化等密切联系的疾病特点。因此，癌症的早期预警技术研究对于预防肝癌、预测肝癌的发病趋势具有非常重要的研究价值和社会意义。目前临床上广泛应用的肝癌诊断标志物AFP，对于肿瘤直径小于3cm的肝癌患者其敏感性、特异性均不理想。近几年，国际上许多研究人员发现血清中丰富的多肽资源可以扮演肿瘤标志物这个重要角色，对于肿瘤的早期预警、早期诊断具有重要的研究意义。其中，有报道称多肽Pep5是潜在的肿瘤诊断标志物之一。本论文建立了检测多肽标志物Pep5的ELISA方法，同时应用于肝癌患者的检测分析，评价其诊断肝癌的价值与临床意义。首先我们采用传统的单克隆抗体制备方法成功建立针对Pep5的3株杂交瘤细胞株，即2F6、4F6及7G7，上清抗体的灵敏度均达到10ng/ml。同时制备3种细胞株的腹水抗体，总计41ml，效价均在1:2000000以上。并进行纯化与酶标，共得到纯化抗体28ml，2F6及7F7滴度达0.5ng/ml，4F6为5ng/ml。3种高灵敏度、高特异性的抗体为后续方法建立奠定了基础。应用所制备的抗体，本文分别建立三种检测Pep5的ELISA方法，即直接法、夹心法与竞争法，并分别进行关键条件的优化。直接法优化结果为HRP-2F6浓度1.25ug/ml，血清1:20稀释;夹心法为7G7单抗1:2000包被，HRP-2F6浓度为5μg/ml，血清1:10稀释;竞争法Pep抗原0.5ng包被，HRP-2F6为1:20000稀释，血清1:5稀释。我们使用三种方法分别验证小量样本，其中直接法区分肝癌与正常组效果最好（P多肽进行检测，得到批内与批间CV为1.44%-6.17%，日内与日间CV为2.89%-4.89%，回收率分别为98.98%，99.61%，101.58%。评价结果表明，优化后的直接ELISA法适用于血清中多肽的检测。最后采用直接ELISA法检测420例临床血清，正常组与肝癌组差异显著（P多肽标志物Pep5，可以明显提高肝癌的检测敏感性，对于肝癌血清学诊断具有重要的研究意义。

关键词：单克隆抗体 ELISA 多肽标志物肝癌

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基于蛋白质组学的液质联用蜂蜜真实性检测技术研究

基于蛋白质组学的液质联用蜂蜜真实性检测技术研究

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作者：江唯健浙江大学

学位级别：硕士

掺假掺杂是蜂蜜行业长期存在的问题,对蜂蜜产业的健康发展造成了极其严重的影响。现有的蜂蜜掺假检测方法可以有效、针对性地控制已知的掺假现象,但是缺乏对新型掺假出现的预警和快速反应能力,具有检测技术开发落后于掺假技术和掺假监... 详细信息

掺假掺杂是蜂蜜行业长期存在的问题,对蜂蜜产业的健康发展造成了极其严重的影响。现有的蜂蜜掺假检测方法可以有效、针对性地控制已知的掺假现象,但是缺乏对新型掺假出现的预警和快速反应能力,具有检测技术开发落后于掺假技术和掺假监管成本过高等缺点,导致难以彻底杜绝蜂蜜掺假现象的发生。近年来,基于蛋白组学和代谢组学的生物标志物检测技术在食品真实性检测领域得到广泛应用,为以蜂蜜的内源性蛋白-王浆主蛋白(Major royal jelly proteins,MRJPs)作为蜂蜜的真实性检测标志物的研究奠定了基础。但由于蜂蜜中的蛋白含量较低,目前尚未见有对其进行精准定量检测的研究方法报道。本文以蜂蜜中的MRJPs为研究对象,利用液相色谱串联质谱检测技术建立了蜂蜜中MRJP 1～3的定量分析方法。通过对大量天然蜂蜜样本的检测,建立了真实蜂蜜中的MRJP 1～3含量数据库,并设置了蜂蜜真实性检测阈值。通过与现有蜂蜜掺假检测方法的对比,验证了本方法在蜂蜜真实性检测中的有效性。1、王浆主蛋白MRJPs的定性鉴别利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)对经胰蛋白酶酶解的蜂王浆中的王浆主蛋白进行定性鉴定,以从Uni Prot数据库中获得的MRJPs的肽序列信息为参照,通过Protein Lynx Global Server(PLGS)软件对获得的数据进行比对分析,成功鉴定出8种王浆主蛋白(MRJP1～7和MRJP 9)的一级序列数据,共有108条多肽,其中24条属于MRJP1,28条属于MRJP2,21条属于MRJP3,14条属于MRJP4,11条属于MRJP5,3条属于MRJP6,6条属于MRJP7,1条属于MRJP9。8种王浆蛋白的多肽覆盖率分布于1.7%～76.6%。2、蜂蜜中MRJPs的候选标志多肽的筛选首先,基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-TQMS)对蜂蜜中所有王浆蛋白的候选多肽进行重复性分析,从69条候选多肽中初筛选出峰面积较高,重现性较好的有34条多肽(其MRJP 9的唯一一条多肽因为响应值太低而无法检测出,所以舍去)。然后,按多肽的易酶解性和酶解后稳定性两个标准对所有候选多肽进行标筛选。依据两个评判指标,将所有的候选多肽依次分成5类:(1)A易酶解且稳定;B,易酶解但不稳定;C,不易酶解但稳定;D,不易酶解且不稳定;E,无规律。经过从高到低等级的比较分析,最终成功为MRJP 1筛选出一条属于B类的特异性标志多肽:YNGVPSSLNVISK,为MRJP 2筛选出一条属于A类的特异性标志多肽:TLQMIAGMK;为MRJP 3筛选出一条属于A类的特异性标志多肽:LTVAGESFTVK。3、蜂蜜中MRJP 1～3定量方法的建立与方法学验证通过分别合成MRJP 1～3的3条特异性标志多肽标准品及其同位素标记肽,建立了蜂蜜中MRJP 1～3定量检测的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(UPLC-TQMS)。并通过标准曲线、精密度、回收率,定量限分析,对所建方法进行方法学验证,结果表明本方法科学合理,满足相关要求。采用UPLC-TQMS法,对四种常见的蜂蜜(洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜和荆条蜜)和三种常见的糖浆掺假物(玉米糖浆、大米糖浆和高果糖浆)中的MRJP 1～3进行定量分析。结果表明,MRJP 1～3的3条特异性标志肽在洋槐蜜,荆条蜜,油菜蜜和荔枝蜜中均能检测到,而均不能在玉米糖浆、大米糖浆或高果糖浆中检测到,证实MRJP 1～3是蜂蜜的特异性内源蛋白。模拟糖浆掺假实验的检测结果表明,掺入的高果糖浆的浓度与蜂蜜样品中的MRJP 1～3的含量成负相关(R>0.99),证明了本方法用于部分掺假蜂蜜检测的潜在可能。4、真实蜂蜜中MRJP 1～3含量数据库的建立与应用利用所建UPLC-TQMS方法,对经过真实性验证的70个真实蜂蜜样品进行MRJP 1～3定量分析,建立了包含洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜和荆条蜜的MRJP 1～3真实含量数据库。通过对检测结果的相关性分析,发现不同蜂蜜间的MRJP 1～3总含量存在显著性差异,证明本方法可用于蜂蜜蜜种鉴别。基于MRJP1～3真实含量数据库,分别为四种蜂蜜设置了不同的MRJP 1～3的真实含量阈值,通过对本方法与国标法中的稳定碳同位素比值质谱法(IRMS)对10个市售蜂蜜样品的真实性检测结果进行比较分析,发现两种方法对其中9个蜂蜜样品的真实性判断结果一致,证实了本文所建立的UPLC-TQMS蜂蜜真实性检测方法的有效性。

关键词：王浆主蛋白多肽标志物蜂蜜真实性检测超高效液相色谱串联三重四级杆质谱

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非整倍体胎儿羊水质谱多肽初步筛选

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广东药科大学学报 2020年第5期36卷 724-728页

作者：宿进江张春斌陈晓杭李冬雪罗小金杨洁霞尹爱华高玉山魏凤香黑龙江省佳木斯市佳木斯大学生物学教研室黑龙江佳木斯154007 广东省深圳市龙岗区妇幼保健院中心实验室广东深圳518172 遵义医科大学基础医学院病原生物学教研室贵州遵义563006 广东省妇幼保健院医学遗传中心广东广州510000 广州妇幼保健院产前诊断中心广东广州510000 深圳市龙岗区妇幼保健院产科广东深圳518172

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪Clin-TOF-II研究非整倍体胎儿羊水多肽质谱变化规律。方法选取96例2015年6月-2016年6月来深圳市龙岗区妇幼保健院进行介入性产前诊断的羊水标本。依据染色体核型分析报告筛选得到21、18、XXY... 详细信息

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪Clin-TOF-II研究非整倍体胎儿羊水多肽质谱变化规律。方法选取96例2015年6月-2016年6月来深圳市龙岗区妇幼保健院进行介入性产前诊断的羊水标本。依据染色体核型分析报告筛选得到21、18、XXY、XYY、X 5种染色体非整倍体羊水标本46例,正常标本50例为对照,进一步进行多肽组学质谱分析。结果通过分析正常对照与非整倍体羊水多肽质谱数据,得到124个差异性多肽峰(P多肽峰95个(P多肽峰29个(P多肽峰标本重现性最好。根据2245.8 m/z和1025.7 m/z多肽峰建立羊水非整倍体诊断模型,评估其对鉴别胎儿非整倍体的临床价值。结论径向基函数网络RBF模型可作为区分正常对照组与非整倍体的理想模型。

关键词：非整倍体羊水多肽标志物基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

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