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小反刍兽疫病毒N蛋白抗原表位多肽的合成及竞争ELISA方法的建立

小反刍兽疫病毒N蛋白抗原表位多肽的合成及竞争ELISA方法的建立

引用

作者：印春生中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种重大烈性传染病，主要发生于山羊和绵羊等小反刍兽，在国际上已经引起广泛的重视。由于周边国家小反刍兽疫的疫病流行趋势十分严峻，在我国开展小反刍兽疫的病原学、流行病学和疫病诊断的研究具... 详细信息

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种重大烈性传染病，主要发生于山羊和绵羊等小反刍兽，在国际上已经引起广泛的重视。由于周边国家小反刍兽疫的疫病流行趋势十分严峻，在我国开展小反刍兽疫的病原学、流行病学和疫病诊断的研究具有重要意义。本研究根据生物信息学技术原理，应用计算机软件对小反刍兽疫(PPR)病毒的N蛋白的理化性质、二级结构的特性以及蛋白抗原性进行综合分析，并预测出N蛋白的9段可能抗原表位。通过PS3型多肽合成仪，采用Fmoc固相合成原理对其中3条抗原性较强的抗原表位进行化学合成。通过间接ELISA法进行了初步鉴定，合成的3条抗原表位多肽(Pep1、Pep2和Pep3)都能够和小反刍兽疫的阳性动物血清反应，且其中的Pep2多肽能够区分PPR和RP的阳性血清，是PPR病毒N蛋白的特异性抗原表位。将Pep2多肽偶联到KLH蛋白载体上，分三次不同的免疫途径进行免疫6-8周龄Balb／C小鼠。三免后的第三天，采集免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，采用HAT选择性培养。经多次间接ELISA方法筛选得到能够稳定分泌阳性抗体的15株细胞。再经一系列的克隆筛选和鉴定，其中的4F11单克隆细胞含有96条染色体，分泌的单抗为IgG2a亚型，杂交瘤细胞上清单抗的效价达1：256，小鼠腹水单抗的效价为1：2048。通过竞争ELISA方法进行鉴定，单抗能够区分PPR和牛瘟(RP)病毒感染的阳性血清，具有很好的特异性。将Pep2多肽偶联到BSA蛋白载体上，作为PPR竞争ELISA的包被抗原，以4F11单克隆细胞分泌的单抗作为竞争单抗，建立了PPR竞争ELISA方法。应用建立的竞争ELISA方法对381份血清样品进行检测，结果表明所建立的竞争ELISA方法和OIE的标准竞争ELISA试剂盒的总符合率为96.85％。

关键词：小反刍兽疫N蛋白抗原表位多肽合成与鉴定单抗制备竞争ELISA

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