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多聚磷酸盐激酶基因在污水生物除磷中的功能

环境科学 2017年第4期38卷 1529-1535页

作者：南亚萍周国标袁林江西安建筑科技大学环境与市政工程学院西安710055

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk^-Kan^+... 详细信息

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk^-Kan^+.将p CP20导入大肠杆菌E.coli/ppk^-Kan^+以消除卡那霉素抗性基因,通过负抗性筛选及正反向引物验证,构建无抗生素抗性的ppk基因缺失工程菌株E.coli/ppk^-Kan^-.比较工程菌株和野生型菌株的生长特性,并比较两者在缺磷诱导/富磷及多次厌氧/好氧诱导条件下的除磷性能.结果表明采用Red重组系统,通过无痕敲除,成功构建了大肠杆菌ppk基因缺失菌株E.coli/ppk^-Kan^-.敲除后的工程菌株和野生型菌株生长整体没有差异,但是4 h前对数期工程菌株生长快于野生型菌株,8 h后稳定期工程菌株生长慢于野生型菌株,表明ppk影响菌体的生长;缺磷诱导/富磷条件下,工程菌株并未表现出因ppk缺失而影响其除磷能力;经过5次厌氧/好氧诱导,两菌菌体含磷量保持在1%~2%,没有因诱导次数的增加而表现出菌体含磷量增加的趋势,也未发现厌氧有PHB好氧有聚磷颗粒生成,表明ppk基因的缺失并没有引起菌体除磷能力的下降.ppk并未表现出明显的与污水生物除磷相关的功能.

关键词：污水生物除磷大肠杆菌无痕敲除多聚磷酸盐激酶除磷性能

多聚磷酸盐激酶在鲍曼不动杆菌致病性和持留性中的作用研究及其抑制剂的筛选

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多聚磷酸盐激酶在鲍曼不动杆菌致病性和持留性中的作用研究及其抑...

作者：吕红发吉林大学

学位级别：硕士

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,A.baumannii)是临床上重要革兰氏阴性耐药致病菌,尤其是耐药持留菌的形成,严重制约抗菌药物的疗效。2017年WHO公布的急需解决耐药性细菌中,耐碳青霉烯A.baumannii位居榜首。但是A.baumannii在兽... 详细信息

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,A.baumannii)是临床上重要革兰氏阴性耐药致病菌,尤其是耐药持留菌的形成,严重制约抗菌药物的疗效。2017年WHO公布的急需解决耐药性细菌中,耐碳青霉烯A.baumannii位居榜首。但是A.baumannii在兽医领域内的流行及其感染等研究相对滞后。近年来,A.baumannii在兽医临床上分离率和感染率逐渐增多,其致病性和耐药性更是呈现逐年增强的趋势,可引起畜禽、宠物和水产动物等多种动物感染。此外,伴侣动物数量上升和角色变化导致A.baumannii逐步成为动物医院院内感染的重要耐药性病原菌,增加了A.baumannii在动物和人之间的传播。A.baumannii具有强大的耐药性获得能力,进一步促进临床细菌耐药性的传播、威胁人类健康和增加动物医院治疗成本。因此临床上急需开展抗A.baumannii感染的靶标和先导化合物研究。多聚磷酸盐激酶(PPK)是催化细菌ATP或GTP形成高能磷酸化合物多聚磷酸盐(poly P)的关键酶,在细菌滑行运动、生物被膜形成、黏附与侵入、相关毒力因子表达和细菌持留中发挥重要作用。此外,PPK对于细菌抵抗外界氧化,高渗,低渗,酸或碱和紫外辐射等压力也至关重要。因此PPK是应对细菌致病性和持留性的重要靶点。目前,尚无PPK在A.baumannii致病性和持留性作用中的研究,因此通过基因敲除来阐明PPK这一潜在作用为A.baumannii防治具有重要意义。本研究首先成功构建了A.baumannii ATCC 17978 PPK1缺失株(Δppk1::Apr)和PPK1回补株(Δppk1::Apr/PJL02-ppk1),通过菌体内poly P定量测定、滑行运动试验、生物被膜形成试验、细菌持留性试验和非靶向代谢组学分析确定PPK1对A.baumannii致病性和持留性的影响;其次建立A.baumannii感染小鼠模型,探究了PPK1在A.baumannii小鼠肺炎模型中的作用;最后通过纯化重组PPK1蛋白,以PPK1为靶标进一步开展了抑制剂筛选及其对A.baumannii致病性和持留性的影响。研究结果表明PPK1在A.baumannii菌体内poly P形成、细菌致病性和持留性维持发挥着不可或缺的作用。与野生型A.baumannii菌株相比,PPK1缺失菌株菌体内poly P含量降低32.13%;透射电镜显示PPK1缺失菌株缺少菌毛类似结构,其滑行运动直径下降了74.56%;生物被膜形成试验表明PPK1缺失菌株生物被膜量与野生型相比降低4.5×log单位;在各种外界压力刺激下,PPK1缺失菌株对于40×MIC氨苄青霉素,HO刺激和热刺激下细菌存活数相比野生型菌株分别下降1.1×log单位、7.0×log单位和1.0×log单位,在饥饿刺激下,PPK1缺失菌株表现生长抑制;细菌非靶向代谢组学分析显示PPK1参与细菌甘油磷脂代谢和脂肪酸合成代谢;在体内小鼠感染模型中,PPK1缺失菌株感染组小鼠肺组织细菌定殖量与模型组相比降低0.97×log单位和呈现明显缓解的炎症反应;PPK1抑制剂根皮素可有效降低A.baumannii菌体内poly P的含量,细菌滑行运动能力,生物被膜形成,外界不良刺激压力下(40×MIC氨苄青霉素、HO刺激和热刺激)的细菌持留能力,从而体内外抑制A.baumannii致病力。综上,本研究证实了PPK1在A.baumannii致病性和持留性中发挥着不可获缺的作用,是抗A.baumannii感染的重要潜在靶标;发现了根皮素靶向PPK1活性呈现良好的抑制A.baumannii致病性和持留性作用。本研究为A.baumannii感染防治提供了新的靶点和潜在先导化合物。

关键词：多聚磷酸盐激酶鲍曼不动杆菌致病性持留性抑制剂

多聚磷酸盐激酶的筛选、理性改造及在谷胱甘肽合成中的应用

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多聚磷酸盐激酶的筛选、理性改造及在谷胱甘肽合成中的应用

作者：高惠江南大学

学位级别：硕士

多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinases,PPK)因其底物聚磷酸廉价易得,已参与到许多生物催化反应中,为ATP消耗反应提供能量。在本研究中,为得到更高酶活的PPK酶,对PPK酶进行胞外胞内高通量筛选,结合理性设计突变改造PPK酶。基于该突变酶... 详细信息

多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinases,PPK)因其底物聚磷酸廉价易得,已参与到许多生物催化反应中,为ATP消耗反应提供能量。在本研究中,为得到更高酶活的PPK酶,对PPK酶进行胞外胞内高通量筛选,结合理性设计突变改造PPK酶。基于该突变酶,构建了ATP再生系统,偶联谷胱甘肽双功能酶Gsh AB生产谷胱甘肽,增强ATP再生能力来提高谷胱甘肽产量,降低催化成本,并对生产体系进行优化,实现高效生产谷胱甘肽。主要结果如下:(1)根据PPK的分类及进化树分析,在大肠杆菌中克隆表达了七种不同来源的多聚磷酸盐激酶,研究底物poly P磷酸盐链的长度和浓度对PPKs的酶活影响。结果表明七种PPK酶对底物六偏磷酸钠poly P的催化能力最好,磷酸盐浓度越高,对PPK的酶活抑制作用越强;来源哈氏纤维细菌的Ch PPK比酶活最高,为30.26±2.08 U·mg,是七种PPK酶利用底物poly P再生ATP的最佳生物催化剂。(2)易错PCR构建Ch PPK突变体文库,结合胞外胞内高通量筛选法以及定点突变,最终筛选到双突变体Ch PPK的相对酶活提高到430.2%,展现最高的催化能力。分子对接发现,关键位点D82和K103残基分别位于底物poly P通道和ADP通道的入口,并与底物的磷酸基团形成离子相互作用,突变后,N82和E103仍扩大了底物通道腔来提高Ch PPK的催化活性。通过RMSD和RMSF的分析发现,D82N和K103E的突变提高了分子结构灵活性,促进了底物(poly P和ADP)与活性口袋之间的相互作用。(3)在突变酶Ch PPK与Gsh AB偶联的EB13全细胞催化体系中,添加5m M ATP,40 h内可将50 m M底物转化产生14.2±1.2 m M的谷胱甘肽,可以达到EB11(表达Gsh AB酶)全细胞催化体系(给予100 m M ATP)的91.6%的效果,比未突变的Ch PPK与Gsh AB偶联的催化产量提高了59.6%。对催化体系的缓冲液、菌体量、补料时间和底物浓度优化后,40 h时EB13菌株可以将50 m M底物转化生成34.1±2.6 m M的谷胱甘肽,底物半胱氨酸转化率为68.2%;而当底物浓度为100 m M时,40 h时谷胱甘肽产量最高,为51.5±1.3 m M,底物半胱氨酸转化率为51.5%。(4)为进一步提高谷胱甘肽生产过程中的转化率,将菌株EB11、EB12、EB13破碎细胞后以无细胞裂解液的形式催化谷胱甘肽的生产。Ch PPK与Gsh AB偶联,添加5 m M ATP,即可获得高效的ATP再生效率,8 h内可将50 m M底物转化产生27.1±1.9 m M的谷胱甘肽,比未突变的Ch PPK与Gsh AB偶联的催化产量提高了51.4%。对催化体系的缓冲液、菌体量、补料时间和底物浓度优化后,8 h时EB13菌株可以将50 m M底物转化生成46.2±1.4 m M(14.2±0.4 g·L)的谷胱甘肽,底物半胱氨酸转化率最高,为92.4%;当底物浓度为100 m M时,8 h时谷胱甘肽产量最高,为67.5±1.7 m M(20.7±0.5 g·L),底物半胱氨酸转化率为67.5%。

关键词：多聚磷酸盐激酶 ATP 高通量筛选理性改造谷胱甘肽

多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

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中国生物制品学杂志 2020年第5期33卷 493-497页

作者：曾李婷肖仪彭亮广州医科大学附属第五医院检验科广东广州510700

目的原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性。方法采用PCR法从尿路致病性E.coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱... 详细信息

目的原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性。方法采用PCR法从尿路致病性E.coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经His-镍亲和层析柱分离纯化后,采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28a-ppk经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组蛋白的相对分子质量约80000,纯化后蛋白浓度为518.9μg/mL。在加入10μg PPK酶,37℃孵育30 min的条件下测得的PPK酶活性最大,为(645.16±32.98)U/mg。结论成功在E.coli中表达了重组PPK,纯化产物纯度较高,具有PPK酶活性,为后续以PPK为靶点新型抗菌药物的研发奠定了基础。

关键词：多聚磷酸盐激酶基因重组蛋白表达酶活性

多聚磷酸盐激酶在重组菌pHT01-PPK/WB800N中的表达及酶活性研究

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多聚磷酸盐激酶在重组菌pHT01-PPK/WB800N中的表达及酶活性研究

作者：何鑫南华大学

学位级别：硕士

目的:构建含多聚磷酸盐激酶(PPK)基因的重组质粒p HT01-PPK,电转化至枯草芽孢杆菌WB800N中,并研究蛋白表达及测定酶活性,为慢性肾脏病-矿物质与骨代谢紊乱(CKD-MBD)高磷血症的治疗提供新的方法。方法:1.根据Gen Bank中已知的多聚磷酸盐... 详细信息

目的:构建含多聚磷酸盐激酶(PPK)基因的重组质粒p HT01-PPK,电转化至枯草芽孢杆菌WB800N中,并研究蛋白表达及测定酶活性,为慢性肾脏病-矿物质与骨代谢紊乱(CKD-MBD)高磷血症的治疗提供新的方法。方法:1.根据Gen Bank中已知的多聚磷酸盐激酶(大肠杆菌K2)的基因序列(NC00913.3),进行生物合成得到多聚磷酸盐激酶PPK基因片段(2085bp)。根据PPK基因序列设计引物,进行双酶切、胶回收和纯化后,与双酶切后的质粒p HT01连接构建成重组质粒p HT01-PPK,化学转化至大肠杆菌DH5α,筛选进行菌液PCR、双酶切及测序鉴定。2.鉴定阳性的转化子提取重组质粒p HT01-PPK,电转化至枯草芽孢杆菌WB800N中,并筛选鉴定枯草阳性克隆菌,向p HT01-PPK/WB800N基因工程菌中加入IPTG(终浓度为1mmol/l)诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE、Western Blot分析。3.将能正确表达目的蛋白的p HT01-PPK/WB800N基因工程菌接种于含特定磷酸盐浓度和IPTG的LB培养基中,作用24小时,测定并计算作用前后的磷酸盐浓度,鉴定其酶活性。结果:1.成功构建目的片段多聚磷酸盐激酶基因(PPK),进行PCR扩增,电泳后显示大小约为2085bp,与理论值相符;2.重组质粒p HT01-PPK化学转化至大肠杆菌DH5α中,进行菌液PCR、双酶切,电泳显示PPK大小约为2085bp,与理论值符合,进行DNA测序鉴定,Bio Edit分析结果显示与Genbank(NC00913.3)上序列一致;3.重组质粒p HT01-PPK电转化至枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞中,IPTG诱导后实现蛋白表达。经SDS-PAGE分析:与未诱导组相比,1m M的IPTG诱导组可见一分子量约为81KD的条带,与理论值相符;Western Blot分析:诱导组p HT01-PPK/WB800N,在分子量约为81KD处有一特异性条带,与目的蛋白理论值大小一致;4.基因工程菌p HT01-PPK/WB800N的酶活性测定:与枯草空菌组和空载组相比,p HT01-PPK/WB800N组溶液中磷酸盐浓度较之均下降,且差异有统计学意义(P多聚磷酸盐激酶活性。结论:PPK基因成功构建到枯草芽孢杆菌WB800N中,工程菌能表达多聚磷酸盐激酶,且具有酶活性。

关键词：多聚磷酸盐激酶 PPK pHT01 枯草芽孢杆菌WB800N

结核分枝杆菌多聚磷酸盐激酶2核酸适配体的抗结核效果评价

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上海交通大学学报（医学版） 2018年第1期38卷 36-41页

作者：杨扬李岱容黎友伦陈雨晗万秋刘静姝重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科重庆400016

目的·探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)多聚磷酸盐激酶2(polyphosphate kinase 2,PPK2)核酸适配体对体外MTB的抑菌效果。方法·运用生物信息学方法分析MTB PPK2与呼吸道部分常见病原菌的同源性,构建PPK2进化树。通过... 详细信息

目的·探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)多聚磷酸盐激酶2(polyphosphate kinase 2,PPK2)核酸适配体对体外MTB的抑菌效果。方法·运用生物信息学方法分析MTB PPK2与呼吸道部分常见病原菌的同源性,构建PPK2进化树。通过酶联寡核苷酸分析(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)测定PPK2核酸适配体与MTB标准株H_(37)Rv、卡介苗(BCG)、耻垢分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的结合亲和力。将PPK2核酸适配体加入血清中孵育24 h,运用琼脂糖凝胶电泳分析其在血清中的生物稳定性。采用微量刃天青显色法测定PPK2核酸适配体对H_(37)Rv的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。将H_(37)Rv与1μmol/L的PPK2核酸适配体在罗氏培养基上培养10 d,观察菌落生长情况。运用酶标仪测定与不同浓度的PPK2核酸适配体共培养10 d后H_(37)Rv菌液的D(600 nm)值,观察PPK2核酸适配体对H_(37)Rv生长的影响。结果·生物信息学方法构建的PPK2进化树显示,H_(37)Rv的PPK2蛋白与呼吸道部分常见病原菌亲缘性较远,与铜绿假单胞菌亲缘关系相对较近。ELONA测定结果显示PPK2核酸适配体能与H_(37)Rv选择性结合。琼脂糖凝胶电泳分析显示PPK2核酸适配体在血清中至少稳定存在8 h。PPK2核酸适配体对H_(37)Rv的MIC为50 nmol/L。罗氏培养基菌落生长结果显示PPK2适配体对H_(37)Rv生长具有抑制作用。生长抑制试验表明随着PPK2核酸适配体浓度增加,H_(37)Rv的D(600 nm)呈现下降趋势,说明PPK2核酸适配体对H_(37)Rv生长存在抑制作用。结论·PPK2核酸适配体对体外H_(37)Rv表现出良好的抑菌活性。

关键词：多聚磷酸盐激酶核酸适配体结核分枝杆菌抑菌活性

Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达

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土壤学报 2007年第4期44卷 727-733页

作者：管莉菠蔡天明李波何健李顺鹏崔中利南京农业大学生命科学学院微生物学系南京农业大学农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约... 详细信息

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约528 bp)。随后采用快速染色体步移方法(Self-formed adap-tor PCR,SEFA-PCR)技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp(GenBank accession number DQ133537)。构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物。且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%(对照菌株的磷去除率仅为18%),远高于已报道的40%的去除率。这表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐。

关键词：多聚磷酸盐激酶 ppk全基因及上下游序列快速染色体步移方法(SEFA—PCR)

聚磷菌多聚磷酸盐激酶的分子生物学研究及高效除磷工程菌的构建

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聚磷菌多聚磷酸盐激酶的分子生物学研究及高效除磷工程菌的构建

作者：李波南京农业大学

学位级别：硕士

水体富营养化是全球十大环境问题之一,氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。为解决磷污染所带来的危害,在污水进入水体前进行有效处理,降低排放污水的磷浓度十分必要。强化生物除磷工艺(Enhancedbiological phosphorus rem... 详细信息

水体富营养化是全球十大环境问题之一,氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。为解决磷污染所带来的危害,在污水进入水体前进行有效处理,降低排放污水的磷浓度十分必要。强化生物除磷工艺(Enhancedbiological phosphorus removal,EBPR)是目前世界各国普遍使用的方法,该工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特点。EBPR系统中聚磷茵在磷的去除过程中起着至关重要的作用。为此,加大对聚磷菌的聚磷特性、聚磷相关基因及聚磷菌的工程化应用进行研究十分必要。本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线,以一株高效聚磷茵GM6为研究材料,一方面系统研究了ppk1编码的多聚磷酸盐激酶被敲除后对菌体生理生化性质的影响,另一方面通过强化表达ppk1编码的多聚磷酸盐激酶和PHA操纵元(phaC1-phaZ-phaC2)构建了两株高效除磷工程菌并结合本实验室已获得的phaZ突变株对EBPR系统中碳磷循环代谢进行研究。1.ppk1突变对Pseudomonas putida GM6特性的影响及ppk2基因的克隆ppk基因编码多聚磷酸盐激酶,主要负责多聚磷酸盐(Poly-P)的合成。大多数微生物体内编码PPK的基因都有ppk1和ppk2两类。通过同源重组敲除ppk1后,突变株在菌体形态,生理生化等方面发生显著变化:通过扫描电镜观察发现突变株较之原始菌株表面粗糙有凹凸不平感,且部分细胞一端或两端同时有凹陷,生长速度变慢,代时增加25%,生物膜形成能力下降50%,游动性与抗逆能力与原始菌株相比显著降低,这都可能是由于菌体多聚磷酸盐激酶活性的丧失,使细胞内Poly-P水平降低或是Poly-P链长组成发生变化,从而引发细胞功能的降低或缺失。而突变株与原始菌株相比在除磷能力上并没有显著变化,这可能是由于GM6中还存在着另一个编码多聚磷酸盐激酶的基因(ppk2)。根据种属间的同源性,利用快速染色体步移方法克隆了ppk2基因,并将其定向克隆到pET29a载体上进行表达,为进一步研究多聚磷酸盐激酶的功能打下了基础。2.高效聚磷基因工程茵的构建通过PCR方法从高效聚磷菌株GM6总DNA中扩增得到了ppk1、PHA及其自带的启动子,并定向克隆到pBBR1MCS-5载体上,构建了重组质粒pMEPE-PPK和pMEPE-PHA,在辅助质粒pRK2013的帮助下,通过三亲接合将pMEPE-PPK及pMEPE-PHA转移到原始菌株GM6中,获得的工程菌P.putidaGM6-PPK1和GM6-PHA。两株工程菌除磷能力较原始菌株GM6和对照菌株GM6-P5有了显著提高,而且在无抗性条件下质粒稳定,因此有着潜在的应用前景。通过模拟EBPR工艺,发现GM6-PPK1和GM6-PHA在厌氧/好氧交替的环境条件下强化表达不但提高了菌体好氧段的吸磷能力,而且厌氧段磷的释放和PHA的合成较之原始菌株也有显著增加,这说明ppk1和PHA的强化表达,不但增强了菌体的除磷能力,也在一定程度上提升了碳磷循环代谢的能力,使得菌体有更好的除磷和除COD的能力。

关键词：强化生物除磷多聚磷酸盐多聚磷酸盐激酶基因工程菌

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联合酶法合成甘露糖-6-磷酸的研究

联合酶法合成甘露糖-6-磷酸的研究

作者：邓艳大连海洋大学

学位级别：硕士

甘露糖-6-磷酸（Mannose-6-phosphate,M6P）在人体新陈代谢过程中扮演着重要的角色,不仅参与到糖酵解过程中,还与溶酶体的合成有关。通过对甘露糖-6-磷酸受体识别功能的不断深研究,发现甘露糖-6-磷酸类似物可用于治疗各种癌症、改善皮... 详细信息

甘露糖-6-磷酸（Mannose-6-phosphate,M6P）在人体新陈代谢过程中扮演着重要的角色,不仅参与到糖酵解过程中,还与溶酶体的合成有关。通过对甘露糖-6-磷酸受体识别功能的不断深研究,发现甘露糖-6-磷酸类似物可用于治疗各种癌症、改善皮肤、治疗特发性肺纤维化等疾病。近年来食品与医药领域逐渐重视甘露糖-6-磷酸的功能。使用联合酶法合成甘露糖-6-磷酸,节省了三磷酸腺苷的消耗成本,并且酶催化合成具有高效、环保等特点,适合工业扩大培养。论文的主要内容包括检测方法的建立、重组菌株的构建、培养条件及蛋白表达优化、反应条件优化等几方面。论文的具体研究结果如下:研究对多聚磷酸盐激酶产物三磷酸腺苷与葡萄糖激酶原料甘露糖进行定量检测,再对甘露糖-6-磷酸进行定性检测。利用高效液相色谱-紫外检测器检测三磷酸腺苷,并对检测条件进行优化,最佳检测条件为:C18柱（I.D.4.6mm x 200mm,5μm）,流动相A为50.0 mmol/L的磷酸盐缓冲液,B为乙腈溶液,A:B=75:25;柱温30.0℃;进样量1μL,流速1.0 m L/min。最终测得三磷酸腺苷标准曲线方程为:y=749.79x+13035,R=0.9987。利用高效液相色谱法-示差检测器检测甘露糖,检测条件为:氨基柱（4.6mm x 250mm,5μm）,柱温在30.0℃;检测器温度40.0℃,流动相A乙腈:B水=75:25;流速1.0 m L/min。甘露糖标准曲线方程为:y=59.521x+3132.9,R=0.9956。构建了来源于大肠杆菌K12的葡萄糖激酶（GLK）与来源于泗阳鞘氨醇杆菌的多聚磷酸盐激酶（PPK2）的重组菌株,进行诱导培养,离心破碎纯化目的蛋白,并利用SDSPAGE检测目的蛋白表达。对多聚磷酸盐激酶、葡萄糖激酶重组菌株培养基种类、诱导时间与葡萄糖激酶重组菌株培养条件进行优化。最终得出多聚磷酸盐激酶以2.0%的接种量在TB培养基中,37.0℃、180 rpm培养3h后加入0.60 mmol/L的IPTG,18.0℃继续培养12h;葡萄糖激酶以1.0%的接种量在TB培养基中,37.0℃、180 rpm培养4h后加入0.40mmol/L的IPTG,25.0℃继续培养4h目的蛋白的浓度最高。探索反应条件中甘露糖添加量、反应温度、溶液p H、二磷酸腺苷与六偏磷酸钠的浓度、Mg2+浓度、多聚磷酸盐激酶与葡萄糖激酶比例与葡萄糖激酶反应时间等因素对甘露糖-6-磷酸合成的影响。结果显示:在100.0 mmol/L甘露糖、二磷酸腺苷与六偏磷酸钠浓度比为1:3（10.0 mmol/L:30.0 mmol/L）、35.0 mmol/L氯化镁浓度、多聚磷酸盐激酶与葡萄糖激酶的浓度比在1:6（0.50 mg/m L:3.0 mg/m L）、37.0℃、p H=7.0条件下加入多聚磷酸盐激酶150 rpm水浴摇床反应3h后再加入葡萄糖激酶继续反应3h,甘露糖最高消耗率达到84.94%。综上所述,针对产业中对甘露糖-6-磷酸原料的需求,本论文采用基因工程技术和联合酶法完成了甘露糖-6-磷酸的生物合成工作,为企业的功能产品的产业和技术升级提供了新的方法和技术路线支撑。

关键词：多聚磷酸盐激酶葡萄糖激酶甘露糖-6-磷酸联合酶法