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多聚泛素、RC3在大鼠颈总动脉球囊损伤后的表达及辛伐他汀干预作用研究

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多聚泛素、RC3在大鼠颈总动脉球囊损伤后的表达及辛伐他汀干预作...

作者：陈新敬福建医科大学

学位级别：硕士

目的研究多聚泛素(polyubiquitin)、大鼠蛋白酶体第3亚基(rat component 3 of proteasome,RC3)在大鼠颈总动脉球囊损伤后的动态表达及在内膜增生中的作用;观察辛伐他汀对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生及对多聚泛素、RC3表达的影响... 详细信息

目的研究多聚泛素(polyubiquitin)、大鼠蛋白酶体第3亚基(rat component 3 of proteasome,RC3)在大鼠颈总动脉球囊损伤后的动态表达及在内膜增生中的作用;观察辛伐他汀对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生及对多聚泛素、RC3表达的影响,探讨其抑制内膜增生的可能机制。方法雄性SD大鼠88只,随机分为假手术组(8只)、单纯球囊损伤组(48只,包括1天、4天、7天、14天、21天、28天组)、辛伐他汀干预组(32只,包括对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)。建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型,苏木素-伊红(HE)染色光镜下观察血管内膜增生情况;应用RT-PCR观察多聚泛素、RC3 mRNA表达情况,免疫组化方法观察多聚泛素蛋白表达情况。结果球囊损伤后血管内膜增生明显,第28天内膜与中膜(Intima/Media, I/M )厚度比值最高(2.31±0.43 vs control 0.02±0.005 ,P 多聚泛素、RC3 mRNA表达升高,多聚泛素第7天达高峰(1.33±0.26 vs control 0.21±0.04,P 多聚泛素蛋白表达升高,第14天达高峰(21.53±4.09 vs control 4.21±0.78,P 多聚泛素蛋白表达与血管内膜增生呈正相关(r=0.827, P 多聚泛素、RC3的表达。高剂量(40mg·kg·d)辛伐他汀抑制作用最明显,血管I/M厚度比值、多聚泛素mRNA、RC3 mRNA及多聚泛素蛋白表达分别下降了50.22%、63.89%、60.29%和60.52%(P 多聚泛素、RC3 mRNA及多聚泛素蛋白表达增高,球囊损伤后多聚泛素蛋白表达与血管内膜增生呈正相关。辛伐他汀呈剂量依赖性地抑制球囊损伤后血管内膜的增生,可能与其抑制多聚泛素、RC3表达有关。

关键词：大鼠球囊损伤内膜增生多聚泛素 RC3 辛伐他汀

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泛素链的体外制备、磷酸化修饰与标记方法

生物化学与生物物理进展 2022年第8期49卷 1586-1596页

作者：覃凌云聂泽锋唐淳中国科学院精密测量科学与技术创新研究院武汉430071 北京大学化学与分子工程学院北京100871 中国科学院大学北京100049

目的为了制备不同链种类、不同链长及磷酸化修饰的泛素样品。方法本文主要以生物酶法为手段对以上样品的制备路线进行阐述。制备的主要方法分为两种,一是采用逐次添加的方式达到泛素链延长的目的,二是通过一次酶反应制备混合的多聚泛素... 详细信息

目的为了制备不同链种类、不同链长及磷酸化修饰的泛素样品。方法本文主要以生物酶法为手段对以上样品的制备路线进行阐述。制备的主要方法分为两种,一是采用逐次添加的方式达到泛素链延长的目的,二是通过一次酶反应制备混合的多聚泛素链,然后对不同链长的泛素链进行纯化分离。结果以上两种策略都能达到制备多聚泛素链的目的。进一步,通过对泛素进行磷酸化修饰,制备了磷酸化的泛素样品。通过K11和K48的泛素酶制备了K11/K48分支链泛素。结论基于以上泛素链的制备路线,可以进一步对不同链接形式的不同亚基进行磷酸化修饰等翻译后修饰,也可以通过在特定亚基进行同位素标记及在特定位点引入小分子探针,进而进行NMR和FRET的测定。综上所述,本方法将为从事泛素信号通路和泛素生化研究的科学家提供借鉴和帮助。

关键词：翻译后修饰多聚泛素磷酸化去泛素化酶分支型泛素

马氏珠母贝多聚泛素基因重复单元及3'端非编码区序列的克隆与表达分析

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广东海洋大学学报 2011年第6期31卷 26-31页

作者：王忠良简纪常鲁义善吴灶和广东海洋大学水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东湛江524025 广东海洋大学南海水产经济动物增养殖重点实验室广东湛江524025 广东海洋大学水产学院广东湛江524025

在构建马氏珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴抑制性差减文库的基础上,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆马氏珠母贝多聚泛素基因(PfUb)最后一个重复单元及3'端非编码区(UTR)序列。序列长453 bp,其中3′UTR 219 bp;开放阅读框(ORF)23... 详细信息

在构建马氏珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴抑制性差减文库的基础上,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆马氏珠母贝多聚泛素基因(PfUb)最后一个重复单元及3'端非编码区(UTR)序列。序列长453 bp,其中3′UTR 219 bp;开放阅读框(ORF)234 bp,编码77个氨基酸残基;PfUb重复单元含有7个Lys和1个76Gly泛素基因功能位点。实时荧光定量PCR分析表明,PfUb基因在马氏珠母贝足、外套膜、鳃、闭壳肌、心脏、消化腺、血淋巴7个组织中均有表达,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)能够诱导马氏珠母贝各组织中PfUb基因的表达上调,其中以鳃和血淋巴中的上调表达最为明显;马氏珠母贝血淋巴中,PfUb基因在溶藻弧菌感染2 h后表达量开始上调,并在感染8 h后达到最大。

关键词：马氏珠母贝多聚泛素基因重复单元非编码区克隆表达 RACE RT-PCR

粉尘螨聚泛素样蛋白基因克隆、表达与生物信息学分析

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中国病原生物学杂志 2021年第8期16卷 922-926页

作者：李青青潘瑞琳周鹰袁存银崔玉宝南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科江苏无锡214023 南京医科大学附属无锡儿童医院儿科实验室

目的克隆、表达粉尘螨聚泛素样蛋白(polyubiquitin, poly-u)的编码基因全长并制备表达质粒,对表达产物进行生物学预测和分析。方法根据转录组测序及其功能注释结果,以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR和RACE技术获得全长基因后构建原核表... 详细信息

目的克隆、表达粉尘螨聚泛素样蛋白(polyubiquitin, poly-u)的编码基因全长并制备表达质粒,对表达产物进行生物学预测和分析。方法根据转录组测序及其功能注释结果,以粉尘螨Total RNA为模板,RT-PCR和RACE技术获得全长基因后构建原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)T1R感受态细胞中,利用异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。采用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的生物学特征。结果获得了粉尘螨聚泛素样蛋白的编码基因,全长1 644 bp,构建的原核表达质粒pET28a(+)-poly-u转化BL21后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定均可见目的蛋白条带。生物信息学分析该基因编码的蛋白质由547个氨基酸组成,相对分子质量为61.3×10^(3)。预测二级结构包括α-螺旋(占32.54%)、延伸主链(占15.36%)和无规卷曲(占52.10%),优势表位可能为TGGQQMGR、LEDRRTL、IQDKEQIPPDQ。结论成功获得粉尘螨聚泛素样蛋白的编码基因全长及其原核表达质粒,,并对其生物学特征进行了分析,为进一步针对该基因开发尘螨防制措施奠定了基础。

关键词：粉尘螨尘螨生物信息学基因克隆泛素多聚泛素