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微生物学报 2020年第1期60卷 106-117页

作者：翁静怡步绪亮徐俊徐岷涓上海交通大学系统生物医学教育部重点实验室系统生物医学研究院上海200240 上海交通大学微生物代谢国家重点实验室生命科学技术学院上海200240

【目的】通过基因组挖掘的方法,研究红树林来源白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9中多环稠合大环内酰胺(PTMs)类化合物的结构多样性。【方法】通过生物信息学分析白骨壤链霉菌基因组序列,寻找PTMs类化合物的生物合成相关基因;利... 详细信息

【目的】通过基因组挖掘的方法,研究红树林来源白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9中多环稠合大环内酰胺(PTMs)类化合物的结构多样性。【方法】通过生物信息学分析白骨壤链霉菌基因组序列,寻找PTMs类化合物的生物合成相关基因;利用UPLC-MS/MS技术对该菌的次级代谢产物进行分析。【结果】在白骨壤链霉菌基因组中发现PTMs生物合成基因簇(aviA-D);从菌液提取物中鉴定出5个PTMs类化合物,其中包括ikarugamycin(化合物1)和capsimycin B(化合物2);基于PTMs类化合物5-6-5环类型的MS/MS碎裂规律,对化合物3–5的结构进行了推测。【结论】红树林来源白骨壤链霉菌S.avicenniae 9-9具有产生5-6-5环类型的PTMs类化合物的能力。

关键词：红树林白骨壤链霉菌次级代谢产物多环稠合大环内酰胺生物合成

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红树林源链霉菌中厦门霉素及多环稠合大环内酰胺类化合物的结构多样性研究

红树林源链霉菌中厦门霉素及多环稠合大环内酰胺类化合物的结构多...

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作者：翁静怡上海交通大学

学位级别：硕士

红树林来源微生物的次生代谢产物结构丰富、生物活性多样,是新药开发的重要来源。本课题对红树林来源的厦门链霉菌Streptomyces xiamenensis 318产生的苯并吡喃类(benzopyran)化合物厦门霉素和白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9... 详细信息

红树林来源微生物的次生代谢产物结构丰富、生物活性多样,是新药开发的重要来源。本课题对红树林来源的厦门链霉菌Streptomyces xiamenensis 318产生的苯并吡喃类(benzopyran)化合物厦门霉素和白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9产生的多环稠合大环内酰胺类化合物(polycyclic tetramate macrolactams,PTMs)的结构多样性展开研究。厦门霉素的生物合成机制明晰,其中最后一步为酰胺合成反应,即厦门霉素B在Xim A作用下加载L-苏氨酸形成厦门霉素A。通过体外生化实验对酰胺合成酶Xim A的酶学特征进行了深入研究,发现其对氨基酸底物的选择具有专一性,依赖于ATP,且经过催化腺苷活化和酰胺合成两步反应。采用计算辅助对蛋白定点突变,与体外酶催化相结合,扩大底物多样性,将氨基酸取代侧链从单一的L-苏氨酸替换为多种氨基酸。基于计算机模拟建立了Xim A蛋白及其与xiamenmycin B-AMP复合物的结构模型。在特定位置对Xim A进行蛋白质工程改造,合理设计了29个Xim A突变体,发现F201活性位点对Xim A的底物选择性至关重要,可以明显扩大酶的底物谱,并成功地合成了15种不同氨基酸(包括11个L型氨基酸和4个D型氨基酸)取代的厦门霉素系列化合物(1-14),增加了该系列活性天然产物的结构多样性,也为后期的抗纤维化构效关系研究奠定了基础。此外,我们通过生物信息学分析,从白骨壤链霉菌9-9的基因组序列中发现编码PTMs类化合物生物合成的基因簇,即avi A-D。通过发酵培养、产物提取、结构鉴定,发现该菌株能够产生PTMs类化合物,鉴定了2个PTMs类化合物,包括ikarugamycin(15)和capsimycin B(16)。并采用UPLC-MS的方法,根据5-6-5环类型PTMs类化合物的二级质谱碎裂规律,对产量比较低的化合物17、18、19的结构进行了初步鉴定,推测化合物17为C-3羟基取代epoxyikarugamycin;化合物18是在capsimycin B侧链上具有双键的结构;化合物19是侧链C-30羟基取代ikarugamycin。红树林来源白骨壤链霉菌9-9具有产生多种5-6-5环类型的PTMs类化合物的能力。

关键词：厦门霉素多环稠合大环内酰胺生物合成酰胺合成酶蛋白质工程

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厦门链霉菌318中capsimycin类化合物的结构多样性及后修饰机制的研究

厦门链霉菌318中capsimycin类化合物的结构多样性及后修饰机制的...

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作者：余河霖上海交通大学

学位级别：硕士

红树林来源放线菌的次级代谢产物结构新颖、活性多样,是开发治疗重大疾病的新药物的源泉。本研究对红树林源厦门链霉菌318菌株中多环稠合大环内酰胺类化合物(polycyclic tetramate macrolactams,PTMs)进行分离和鉴定,并对其药理活性进... 详细信息

红树林来源放线菌的次级代谢产物结构新颖、活性多样,是开发治疗重大疾病的新药物的源泉。本研究对红树林源厦门链霉菌318菌株中多环稠合大环内酰胺类化合物(polycyclic tetramate macrolactams,PTMs)进行分离和鉴定,并对其药理活性进行了体外评价,同时,重点研究了一个新的细胞色素P450单加氧酶在PTMs化合物后修饰过程中的作用。利用现代色谱方法和波谱学技术,从厦门链霉菌318中分离鉴定得到六个化合物,包括ikarugamycin(1)、capsimycin(2)和capsimycin B(3)三个已知化合物,以及三个新化合物—capsimycin C(4)、capsimycin D(5)和capsimycin G(3’)。通过综合解析核磁共振(NMR)数据、分析圆二色光谱(CD)以及过渡金属试剂Mo(OAc)诱导圆二色光谱(induced CD)等数据,确定了capsimycin C(4)的反式tert/tert邻二醇立体构型。考察了在不同条件下,带有三元氧环结构的化合物capsimycin(2)和capsimycin B(3)的稳定性,总结了其非酶催化的变化规律,并得到了其各自的甲氧基化衍生物capsimycin E(6)和capsimycin F(7)。根据化合物1-7的二级质谱(MS/MS)碎裂的特点,总结了PTM类化合物的质谱规律,提出了一种基于二级质谱数据的判断5-6-5环PTMs化合物结构类型的方法。基于对PTM类化合物结构多样性的分析,发现ikarugamycin(1)是生物转化过程中的重要中间体,能够通过在C-13/C-14位发生氧化形成三元氧环而生成capsimycin B(3),并进一步在C-30位的羟基化形成capsimycin G(3’)。研究了位于PTM生物合成基因簇附近的细胞色素P450超家族基因SXIM0690(ikaD)的功能。通过在厦门链霉菌318中基因敲除和回补实验,以及异源表达IkaD和体外生化实验,证实IkaD催化C-13/14位环氧化形成capsimycin B(3),之后进一步催化C-30乙基侧链上羟基化形成capsimycin G(3’)。采用表面等离子体共振测定ikarugamycin(1)和capsimycin B(3)与IkaD之间相互作用的结合亲和力和动力学参数。采用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)实验方法,对该类化合物(1-7)进行体外药理活性的筛选和初步的毒性评价。化合物1-3具有抗胰腺癌细胞增殖活性,IC范围为1.30-3.37μM。通过本课题,对红树林源的厦门链霉菌318菌株中PTM类化合物进行了化学研究,结构鉴定新PTM类化合物3个,对纯品化合物进行抗肿瘤活性筛选,发现具有抗胰腺癌的活性化合物3个,并进行了初步的构效关系分析和毒性评价。进一步对PTM类化合物的后修饰机制进行了研究,通过异源表达和体外生化实验,阐明了一类新的细胞色素P450单加氧酶IkaD催化ikarugamycin环氧化和羟基化的后修饰过程。

关键词：厦门链霉菌 Capsimycins 细胞色素P450单加氧酶多环稠合大环内酰胺抗胰腺癌活性

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