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基于转录组学分析刺糖多孢菌多杀菌素合成代谢途径关键酶基因挖掘

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微生物学报 2024年

作者：王晓宇蔡朝辉乔长晟薛超友天津科技大学中国科学院天津工业生物技术研究所

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析，探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路，挖掘代谢途径关键酶基因，探究多杀菌素竞争基因簇，为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-... 详细信息

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析，探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路，挖掘代谢途径关键酶基因，探究多杀菌素竞争基因簇，为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-144 h)进行比较转录组分析，并通过实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR， qRT-PCR)与转录组测序进行相互验证。采用基因本体论(gene ontology， GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)对差异表达基因进行功能和代谢通路注释并进行中心碳代谢分析。【结果】刺糖多孢菌通过转录组测序发现有2 542个差异表达基因，其中具有显著上调基因1 188个，显著下调基因1 354个。GO注释表明，差异表达基因主要参与羧酸代谢过程、含氧酸代谢过程、有机酸代谢过程和氨基酸代谢过程。KEGG富集结果表明，差异表达基因主要参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，以及氧化磷酸化和精氨酸生物合成等通路。进一步分析得到7条与多杀菌素生物合成相关基因，其中accB、Pfk、G6PD、dsdA表达量显著上调，而涉及多杀菌素前体消耗的GAPDH、aceE、DLAT以及TCA循环和精氨酸生物合成途径中的基因表达量都呈现显著性下调趋势。qRT-PCR与转录组测序结果发现双方同时上调的基因有12个，分别为BGC2 (43 846 bp)、BGC4 (18 330 bp)、BGC9 (20 501 bp)、BGC18 (62 621 bp)、BGC22 (19 626 bp)、BGC25 (42 896 bp)、BGC26 (40 086 bp)、BGC28 (39 392 bp)、BGC30 (20 282 bp)、BGC31 (53 657 bp)、BGC34 (20 787 bp)和BGC35 (40 232 bp)。【结论】本研究通过转录组学分析获得了不同时期刺糖多孢菌的差异基因以及多杀菌素生物合成通路，并分析了刺糖多孢菌中多杀菌素的竞争基因簇，为后期开展多杀菌素生物合成途径的优化和对刺糖多孢菌进行遗传改造从而达到提高多杀菌素产量的目的奠定了基础。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌转录组分析代谢途径实时荧光定量PCR

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新疆多杀菌素与惰性粉防治储粮害虫对比试验

粮食加工 2024年第2期49卷 109-111页

作者：张小龙张英华李文新疆维吾尔自治区储备粮管理有限责任公司乌鲁木齐830015

新疆地处我国第二储粮生态区,气候低温干燥,夏季温度较高,粮堆表层易发生虫害,为了提高绿色储粮技术运用,不用或者少用储粮化学药剂防治储粮害虫,达到安全储粮的目的,试点运用生物杀虫剂多杀菌素,与对照仓惰性粉物理除虫对比空仓和实仓... 详细信息

新疆地处我国第二储粮生态区,气候低温干燥,夏季温度较高,粮堆表层易发生虫害,为了提高绿色储粮技术运用,不用或者少用储粮化学药剂防治储粮害虫,达到安全储粮的目的,试点运用生物杀虫剂多杀菌素,与对照仓惰性粉物理除虫对比空仓和实仓运用的防治效果,经过比对,使用多杀菌素用药量少,持效期长,防治效果好。由于多杀菌素价格较贵,目前储备粮仓房大批量使用性价比不高,降低药物成本可以提高性价比,推广使用前景广阔。

关键词：新疆多杀菌素生物杀虫持效期长残留低毒性低惰性粉物理除虫

多杀菌素固体缓释剂的制备及对白纹伊蚊的防治效果

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中国兽医杂志 2022年第3期58卷 67-71页

作者：王鸿于泓潇张屿萌张雅琪邓景月赵建国韩谦海南大学生命科学学院海南海口570228 海南大学全健康研究院海南海口570228 海南大学药学院海南海口570228

为了克服传统杀虫剂防治水体中白纹伊蚊幼虫的局限性,解决引诱蚊虫产卵以集中防治的问题,本试验通过物理包埋的方法制备一种具有杀灭与引诱白纹伊蚊作用的复合型固体缓释剂。以多杀菌素作为模型药物,碳酸铵作为诱卵剂,十六醇与聚乙二醇... 详细信息

为了克服传统杀虫剂防治水体中白纹伊蚊幼虫的局限性,解决引诱蚊虫产卵以集中防治的问题,本试验通过物理包埋的方法制备一种具有杀灭与引诱白纹伊蚊作用的复合型固体缓释剂。以多杀菌素作为模型药物,碳酸铵作为诱卵剂,十六醇与聚乙二醇作为药物结合载体,通过高温搅拌混合的方法构建成骨架层-缓释层的复合结构;用高效液相色谱法(HPLC)测定多杀菌素缓释剂的缓释效果;用幼虫浸渍法对缓释剂快速与长效灭蚊效果进行测定;用诱蚊诱卵试验测试缓释剂诱卵效果。结果显示,缓释剂中多杀菌素9 d平均释放率为14.54%,与纯多杀菌素释放相比有良好的缓释效果(P多杀菌素(P多杀菌素固体缓释剂对药物有长效缓释的效果,对白纹伊蚊表现出良好的杀灭与引诱作用,可作为新型防蚊制剂。

关键词：多杀菌素缓释剂白纹伊蚊蚊虫防治

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多杀菌素核酸适配体筛选及适体传感器构建

多杀菌素核酸适配体筛选及适体传感器构建

作者：孙煦茵山东大学

学位级别：硕士

多杀菌素是从刺糖多孢菌的发酵液中提取到的次级代谢产物,被开发为新型杀虫剂,既有作为生物农药的低毒性、环境友好的特点,又能像化学农药一样高效、快速发挥作用,在国内外害虫防治方面具有广阔应用前景。由于多杀菌素的生产方式是微生... 详细信息

多杀菌素是从刺糖多孢菌的发酵液中提取到的次级代谢产物,被开发为新型杀虫剂,既有作为生物农药的低毒性、环境友好的特点,又能像化学农药一样高效、快速发挥作用,在国内外害虫防治方面具有广阔应用前景。由于多杀菌素的生产方式是微生物发酵生产,目前其产量较低、成本较高,限制了其大规模广泛应用。要想通过选育高产菌株及优化发酵工艺的方法来提高其产量,首要的就是要构建快速、高通量的多杀菌素检测方法。生物传感器通过将识别元件与靶标的结合变化转导为可测信号输出,实现对靶标的快速检测。其中,核酸适配体因其亲和性强、易于合成等特点,成为一种很好的识别元件,是生物传感器的重要组成部分。本研究以多杀菌素为靶标,利用磁珠-SELEX技术筛选出识别多杀菌素的核酸适配体,然后基于该核酸适配体分别建立了电化学适体传感器、一次性适体传感器和荧光适体传感器,为多杀菌素的快速检测提供了多种方法。(1)基于磁珠-SELEX法筛选多杀菌素的核酸适配体,并进行测序、鉴定。以多杀菌素为研究对象,设计随机单链DNA文库,固定在链霉亲和素磁珠上,构建基于磁珠的SELEX筛选方法。结合Q-PCR技术,经过六轮筛选得到富集文库,对文库进行高通量测序得到7000余条序列。根据序列的富集情况和序列组成等选出48条候选序列,对这些序列进行系统发育树分析,再利用等温滴定量热技术进行亲和力鉴定。结果显示,06号和11号核酸适配体有热量反应,解离常数分别为518e-6±27.3e-3 M和70.1e-6±612e-6 M,11号核酸适配体的亲和力更强选为最优核酸适配体。(2)构建基于普通金电极的电化学适体传感器。将巯基标记在11号核酸适配体的5’端,自组装在金电极上,滴加6-巯基己-1-醇防止单链DNA倒伏和非特异性吸附,制备得到工作电极。构成三电极体系,利用差分脉冲伏安法对电信号进行检测。通过优化核酸适配体的浓度和自组装时间成功构建了电化学适体传感器,在10-2～102 nmol/L的浓度范围内,峰电流差值与多杀菌素浓度的对数值呈良好的线性关系,检出限为0.01 nmol/L。(3)设计双链探针,构建基于丝网印刷电极的一次性适体传感器。根据11号核酸适配体序列的二级结构设计双链探针,解决了单链DNA存在的分布不均匀、易倒伏的问题。在核酸适配体的5’端和配对引物的3’端分别修饰巯基,通过互补配对形成双链探针,再将其固定在纳米金印刷电极上,用方波伏安法进行电化学检测。通过优化双链探针的浓度和结合温度成功构建了一次性适体传感器,在10-1～104 nmol/L的多杀菌素浓度范围内,峰电流的差值与多杀菌素浓度的对数值呈线性关系,检出限为0.1 nmol/L。(4)构建基于氧化石墨烯的荧光适体传感器,并利用核酸酶实现信号循环放大。在核酸适配体的3’端修饰FAM荧光基团,加入氧化石墨烯(GO)吸附核酸适配体,猝灭荧光;再加入多杀菌素靶标,靶标与核酸适配体形成复合物游离至溶液中,荧光信号得以恢复,过程中利用酶标仪检测荧光信号。通过优化GO浓度、猝灭时间和响应时间成功构建了荧光适体传感器,多杀菌素浓度为1～100μmol/L范围内,荧光强度信号和多杀菌素浓度呈良好的线性关系,检出限为1 μmol/L。引入DNase I进行靶标循环信号放大后荧光强度恢复更加明显,比之前高出一倍左右,检出限低至100 nmol/L,荧光适体传感器的灵敏度提高。

关键词：多杀菌素核酸适配体电化学适体传感器荧光适体传感器

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多杀菌素高时空产率发酵工艺研究

多杀菌素高时空产率发酵工艺研究

作者：孔阳琦河北科技大学

学位级别：硕士

多杀菌素（Spinosad）又名多杀霉素或刺糖菌素,是一种由放线菌中糖多孢菌属的刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的次级代谢物,是一种新型的大环内酯类抗生素。多杀菌素具有杀虫广谱性,对多种害虫都有显著的杀虫效果,且... 详细信息

多杀菌素（Spinosad）又名多杀霉素或刺糖菌素,是一种由放线菌中糖多孢菌属的刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的次级代谢物,是一种新型的大环内酯类抗生素。多杀菌素具有杀虫广谱性,对多种害虫都有显著的杀虫效果,且多杀菌素对于人畜非常安全,因此被广泛应用于防治农作物害虫、作为储粮保护剂等多种领域,被公认为最优良的环境友好型杀虫剂之一。本文以实验室保藏的刺糖多孢菌作为研究对象,旨在通过对菌株诱变选育及对菌株培养条件和发酵培养基的优化来提高多杀菌素的产量,并探究了pH、调控时间和补料发酵对发酵罐发酵工艺的影响,为多杀菌素的工业化生产提供参考。分别通过紫外（UV）诱变和亚硝基胍（NTG）诱变,共筛选出7株突变株,经过遗传稳定性验证,最终筛选出1株遗传稳定的多杀菌素高产菌株16B#,其产素量为265.11 mg/L,高于原始菌株50.1%。通过单因素实验优化发酵条件,得出最优培养条件为初始pH 7.2,温度28℃,接种量10%,装液量每250 m L锥形瓶装液50 m L;又通过单因素实验筛选出最佳碳源氮源无机盐,利用Plackett-Burman实验筛选出显著影响因子,通过最陡爬坡实验确定响应面设计实验的中心点,随后用Box-Behnken响应面设计实验优化得到最佳发酵培养基配方（g/L）为葡萄糖51.176,油酸甲酯50.96,发酵用棉籽饼粉31.549,硫酸镁2,氯化钠3,磷酸氢二钾1,碳酸钙4,消泡剂0.5。优化后产素量达271.008mg/L,较优化前提高了2.22%。优化后的发酵培养基配方更为经济实用。通过发酵罐探索了在不同pH条件下对多杀菌素发酵的影响,得出最适合菌体生长的pH为7.2,最适合多杀菌素合成的pH为6.8。依据最适pH的结果进行两阶段调控,探究维持最适生长pH不同时间对多杀菌素发酵的影响,结果表明在pH 7.2保持84 h后缓慢降低pH至6.8时产素量最高。在此基础上,间歇式流加不同浓度的油酸甲酯进行补料分批发酵,结果表明流加4%的油酸甲酯效果最佳,菌体生物量和产素量分别为36.2 g/L和334.84 mg/L,比不补料发酵分别提高了20.07%和24.397%。然后连续式流加4%油酸甲酯进行补料分批发酵,发现菌体生物量和产素量相较间歇式补料分批发酵有了进一步提高,分别达到38.8 g/L和350.92 mg/L,比间歇式补料发酵提高了7.18%和4.8%。最后通过昆虫实验验证,证实高产菌株相较于原始菌株有更明显的灭虫活性。

关键词：多杀菌素诱变选育响应面设计实验油酸甲酯补料分批发酵

多杀菌素产生菌刺糖多孢菌的菌种选育和发酵工艺研究

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多杀菌素产生菌刺糖多孢菌的菌种选育和发酵工艺研究

作者：李文杰中国医药工业研究总院

学位级别：硕士

多杀菌素是一种从刺糖多孢菌的发酵液中分离出来的生物农药,其活性成分为多杀菌素A和多杀菌素D。与传统化学农药相比,具有降解速度快、选择性强和环境安全等优势,广泛应用于防治田间双翅目、等翅目、膜翅目、鳞翅目等害虫。多杀菌素的... 详细信息

多杀菌素是一种从刺糖多孢菌的发酵液中分离出来的生物农药,其活性成分为多杀菌素A和多杀菌素D。与传统化学农药相比,具有降解速度快、选择性强和环境安全等优势,广泛应用于防治田间双翅目、等翅目、膜翅目、鳞翅目等害虫。多杀菌素的生产主要来自于刺糖多孢菌的次级代谢,但是国内多杀菌素产能较低,不能满足市场需求。本课题主要通过菌种的诱变育种、基因组重排育种以及后续的发酵工艺优化提高多杀菌素的产量,为多杀菌素的工业化奠定基础。首先,对出发菌株进行了紫外辐照诱变和亚硝基胍诱变,经过多轮诱变选育得到了产量提高且稳定的8U-19(110.77mg/L)和6N-1(95.76 mg/L),较出发菌株(25.98 mg/L)分别提高了 3.26倍和2.69倍。在进行基因组重排育种前,通过响应面法(Response Surface Methodology,RSM)优化了原生质体制备、再生和融合的条件。确定了刺糖多孢菌原生质体制备的最佳条件为处理温度28℃,处理时间60.23 min,溶菌酶浓度11.8 mg/mL,制备数约为0.92×108,再生率约3.67%。在50%PEG2000条件下原生质体融合5min,融合率为0.58%;然后以上述菌株为亲本,进行二轮基因组重排育种获得到了一株产量为122.23 mg/L的菌株S.17-1。为了进一步提高产量和探索适合重组菌株的发酵工艺和条件,对获得的S.17-1进行了发酵工艺优化和发酵培养基优化,使其在合适的条件下最大程度发挥生产性能。优化后的发酵工艺为:斜面培养时间为8d,种龄48 h,接种量20%,发酵温度28℃,发酵培养基初始pH7.4,发酵时长为8d;紧接着对根据文献选择了合适的种子培养(g/L):葡萄糖15、淀粉10、黄豆饼粉3、棉籽蛋白3、大豆蛋白胨25、MgSO4·7H2O2,pH7.2;优化后的发酵培养基为(g/L):葡萄糖50;糊精20;鱼粉蛋白胨 30;NaCl20;Na2HPO4·3H2O2.84;FeSO4·7H2O0.06;CaCO35;精氨酸1.5;pH7.2;优化培养基之后多杀菌素的产量为728.72mg/L,相比较未优化前提高了 4.96倍。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌诱变育种基因组重排响应面发酵条件优化

多杀菌素在刺糖多孢菌中的调控因子钓取及体内外验证

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多杀菌素在刺糖多孢菌中的调控因子钓取及体内外验证

作者：李莉天津大学

学位级别：硕士

天然产物多杀菌素是土壤中的放线菌刺糖多孢菌产生的一种大环内酯类抗生素,主要包括多杀菌素A和多杀菌素D。特殊的化学结构使其同时具有生物农药的安全性和化学农药的高效性。目前多杀菌素主要通过发酵生产,而原始菌株刺糖多孢菌的发酵... 详细信息

天然产物多杀菌素是土壤中的放线菌刺糖多孢菌产生的一种大环内酯类抗生素,主要包括多杀菌素A和多杀菌素D。特殊的化学结构使其同时具有生物农药的安全性和化学农药的高效性。目前多杀菌素主要通过发酵生产,而原始菌株刺糖多孢菌的发酵产量很低,导致其产业化应用受到限制。已经有研究通过诱变育种、提高前体供应、发酵条件优化、异源表达等手段提高多杀菌素产量,但多杀菌素合成调控机制的研究仍处于空白。本研究通过验证多杀菌素合成的调控因子,为未来产业化提供思路。本研究选取了多杀菌素合成基因簇中的三个重要启动子,利用DNA pull down实验钓取到了40种调控因子。异源表达和纯化后的调控因子蛋白用于凝胶电泳迁移实验(EMSA),验证其与启动子的结合活性。7种调控因子的EMSA中,A0A2N3XVH2和A0A2N3YA72与启动子Pspn A和Pspn GF显示出较强的体外特异结合活性,A0A2N3YAA0与启动子Pspn A、Pspn GF、Pspn M在体外均有结合活性,但结合特异性相对较弱。随后,利用接合转移实验整合p SET152质粒,使调控因子在红霉素强启动子下过表达,成功筛选出的两株过表达A0A2N3XVH2的菌株S.spinosa LL72和S.spinosa LL84。相较于原始菌株S.spinosa YSDS,其多杀菌素产量显著降低。RT-q PCR实验发现过表达菌株中多杀菌素合成相关基因spn D转录水平相较于原始菌明显降低,证实了A0A2N3XVH2对多杀菌素合成基因转录水平的负调控。刺糖多孢菌的接合转移实验成功率低,因此本课题同时在大肠杆菌中利用EGFP荧光蛋白作为报告基因,异源验证调控因子对启动子的作用。最终得到的A0A2N3XVH2的异源荧光验证结果与刺糖多孢菌体内实验结果一致。本研究钓取获得了40个调控因子,从中成功筛选到3个具有体外结合活性的调控因子,随后发现并验证了A0A2N3XVH2对多杀菌素产量的负调控。本研究为未来多杀菌素合成调控机制的进一步探究奠定了基础。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌发酵调控因子负调控

刺糖多孢菌高产菌株转录组及其多杀菌素合成代谢调控研究

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中国抗生素杂志 2022年第6期47卷 561-568页

作者：王欣荣唐智超曾茂吕正翟龙飞张新宜刘超兰褚以文王克华黄挺成都大学药学院抗生素研究与再评价四川省重点实验室成都610106 华北制药集团爱诺有限责任公司石家庄052165

目的通过对高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行转录组分析,挖掘多杀菌素合成相关代谢通路的差异基因,并在此基础上结合发酵优化进一步提高多杀菌素产量。方法利用RNA-seq技术对高产株SS-168及低产野生菌株SS-WT进行比较转录组分析,通过荧... 详细信息

目的通过对高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行转录组分析,挖掘多杀菌素合成相关代谢通路的差异基因,并在此基础上结合发酵优化进一步提高多杀菌素产量。方法利用RNA-seq技术对高产株SS-168及低产野生菌株SS-WT进行比较转录组分析,通过荧光定量PCR验证差异基因表达,再通过发酵培养基优化考察高产菌株的发酵水平。结果转录组分析表明,与低产菌株相比高产株中有1341个差异表达基因,GO注释表明DEGs主要参与氧化还原生物过程和脂质代谢及辅因子结合和辅酶结合,主要分布在甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、脂肪酸降解等通路。荧光定量PCR结果与转录组数据一致性达到100%。采用分别含有不同浓度的甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸的发酵培养进行筛选,多杀菌素发酵水平显著提高。结论本研究通过新颖的转录组学方法获得了刺糖多孢菌高产菌株的差异基因,并对其高产机制和发酵优化进行了初步分析,为改良刺糖多孢菌菌株和优化发酵工艺提供重要的理论基础和参考依据。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌转录组代谢调控

多杀菌素生物合成基因簇启动子探测和转录时序

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生物工程学报 2013年第7期29卷 914-926页

作者：冯晓洲王为善任晓慧刘新利毛相朝杨克迁山东轻工业学院食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室山东济南250353 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266003

多杀菌素是对农业虫害防治及粮食仓储安全均具有重大意义的农用抗生素。为了深入揭示刺糖多孢菌合成多杀菌素的调控特点,首先通过建立基于报告基因的启动子探测技术,探测了多杀菌素生物合成基因簇的9个启动子活性。并进一步通过荧光定量... 详细信息

多杀菌素是对农业虫害防治及粮食仓储安全均具有重大意义的农用抗生素。为了深入揭示刺糖多孢菌合成多杀菌素的调控特点,首先通过建立基于报告基因的启动子探测技术,探测了多杀菌素生物合成基因簇的9个启动子活性。并进一步通过荧光定量PCR,分析了这9个基因和不在基因簇内的负责糖基前体供应和鼠李糖合成的4个基因的转录时序,结果表明多杀菌素生物合成基因簇内的9个基因在菌体生长进入稳定期时有较高的转录,这和发酵液中此时开始大量积累多杀菌素一致;同时还发现,簇外的4个与糖基供应相关的基因和基因簇内基因的转录时序不同,它们在菌体生长对数期有较高的转录活性,这暗示多杀菌素聚酮链的合成速率和参与后修饰的糖基底物供应的最优化匹配有可能是提高生物合成多杀菌素的前提和关键。

关键词：多杀菌素生物合成基因簇启动子探测转录时序