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溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2014年第6期44卷 624-629页

作者：冯旭飞刀筱芳李定菲汤承王远微杨发龙西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041 四川农业大学动物医学院四川雅安625014

本研究旨在建立溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这两种病原的感染提供一种更加方便、快捷、准确的工具。根据溶血性曼氏杆菌lkt基因和多杀性巴氏杆菌sp6基因分别设计引物,优化条件后进行特异性... 详细信息

本研究旨在建立溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这两种病原的感染提供一种更加方便、快捷、准确的工具。根据溶血性曼氏杆菌lkt基因和多杀性巴氏杆菌sp6基因分别设计引物,优化条件后进行特异性和敏感性的评价,并对180份临床样本进行了检测。结果显示,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌引物的最佳终浓度分别为10和20pmol/L。该方法的特异性较好,对其他无关病原不检出。对溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检测限分别为56和22pg,与独立PCR相同。该方法对临床样本的检测结果表明,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检出率分别为51.67%和47.78%。研究结果表明,本研究建立的双重PCR诊断技术具有特异性好、敏感度高等特点,为临床上溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的快速检测、鉴定以及混合感染的流行病学调查提供了有用的工具。

关键词：溶血性曼氏杆菌多杀性巴氏杆菌双重PCR

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单克隆抗体的制备及潜在应用

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农业生物技术学报 2012年第6期20卷 676-681页

作者：刘燕庞安娜韦强肖琛闻鲍国连季权安钱微浙江省农业科学院畜牧兽医研究所

制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以... 详细信息

制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以纯化复性的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾细胞与SP2/0细胞融合,ELISA筛选出了4株分泌Pm OmpA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5D2、BC11、2A2和6A4。其中2A2细胞培养液效价为1∶256,5D2、BC11和6A4效价为1∶128;2A2腹水效价为1∶12800,其余3株达1∶6400。杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体。Western blot显示,4株单克隆抗体均能与Pm OmpA重组蛋白重组发生特异性反应。用ELISA方法鉴定2A2单克隆抗体亚型为IgG2b,Protein A亲和纯化2A2腹水抗体,获得的单抗浓度为130μg/mL。选取纯化的2A2单克隆抗体进行潜在应用研究,Western blot与间接免疫荧光结果显示,单克隆抗体能与兔多杀性巴氏杆菌分离菌株发生特异性反应。表明利用体外重组表达兔多杀性巴氏杆菌OmpA融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体,可用于兔多杀性巴氏杆菌诊断,本研究结果为兔多杀性巴氏杆菌诊断试剂盒的研制提供技术参数。

关键词：多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A(OmpA) 重组蛋白单克隆抗体

单抗捕获ELISA法检测禽多杀性巴氏杆菌特异性IgM抗体

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畜牧兽医学报 2000年第1期31卷 63-70页

作者：钱建飞徐步陈溥言蔡宝祥毛洪先邵国青凌雯江苏省农业科学院牧医所南京210014 江苏省家禽科学研究所南京农业大学兽医学院

本试验采用纯化的鸡IgG和环磷酰胺预处理后,再以亲和层析纯化的鸡IgM免疫BALB/C小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选,获得了5株能稳定地分泌抗鸡IgM(μ链)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA交叉反应性试验和羊抗鸡IgM... 详细信息

本试验采用纯化的鸡IgG和环磷酰胺预处理后,再以亲和层析纯化的鸡IgM免疫BALB/C小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选,获得了5株能稳定地分泌抗鸡IgM(μ链)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA交叉反应性试验和羊抗鸡IgM(μ链)抗血清阻断试验,证明这5株单克隆抗体均是抗鸡IgM(μ链)特异性的。应用该抗鸡IgM(μ链)单克隆抗体建立了检测鸡抗多杀性巴氏杆菌血清中特异性IgM抗体的抗体捕获ELISA(Mac-ELISA),本法具有很高的特异性和良好的重复性。用于检测鸡抗多杀性巴氏杆菌的特异性IgM抗体发现:鸡在注射免疫接种多杀性巴氏杆菌灭活菌苗后,第4天即可检测到IgM抗体,并且上升较快,峰值在第2周,滴度较高(1∶5120);鸡在口服免疫接种多杀性巴氏杆菌弱毒活菌苗后IgM抗体上升缓慢,峰值在第4周左右,滴度较低(9∶320);鸡由不同途径感染不同的多杀性巴氏杆菌强毒后第8天时,IgM抗体滴度均明显上升。我们认为,Mac-ELISA方法是检测鸡抗多杀性巴氏杆菌特异性IgM抗体的良好方法,本项试验方法对建立检测鸡抗其它病原微生物的特异性IgM抗体方法具有借鉴意义。

关键词：单克隆抗体 ELISA 多杀性巴氏杆菌禽 IgM抗体

禽多杀性巴氏杆菌C48-1株胞外分泌蛋白的DNase活性分析

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 984-989页

作者：陈耀华董何凡李琦牛俊辉钱满王晓利全映颖刘桂坤雷显前程相朝廖成水河南科技大学动物科技学院河南洛阳471023 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471023

为探究多杀性巴氏杆菌(Pm)胞外分泌蛋白的DNase活性及对该蛋白DNase活性影响的因素,本研究经琼脂培养法以λDNA为底物鉴定禽Pm C48-1株胞外蛋白的DNase活性,将Pm培养5 h后采用低温透析法收集禽Pm C48-1株的胞外分泌蛋白,并采用BCA试剂... 详细信息

为探究多杀性巴氏杆菌(Pm)胞外分泌蛋白的DNase活性及对该蛋白DNase活性影响的因素,本研究经琼脂培养法以λDNA为底物鉴定禽Pm C48-1株胞外蛋白的DNase活性,将Pm培养5 h后采用低温透析法收集禽Pm C48-1株的胞外分泌蛋白,并采用BCA试剂盒测定其浓度,进一步利用Kunitz法检测Pm胞外分泌蛋白的DNase活性。结果显示,禽Pm分泌的胞外蛋白能够降解λDNA,即其有DNase活性,且获得的胞外分泌蛋白的浓度为1.32μg/mL,其降解λDNA的活性水平为6.07×10^(6) Kunitz Unit/mg。利用琼脂糖凝胶电泳法检测胞外分泌蛋白降解不同底物DNA的能力以及酸碱、温度和不同浓度金属阳离子对胞外分泌蛋白降解λDNA活性的影响。结果显示,Pm胞外分泌蛋白的DNase活性具有广谱性,可降解λDNA、细菌基因组DNA、质粒DNA和PCR扩增的DNA片段。DNase活性影响因素的检测结果显示,Pm胞外分泌蛋白降解λDNA的最适温度为30℃,在pH7.0~pH9.0时该蛋白的DNase活性较好,而在酸性和强碱性时该蛋白则无DNase活性。不同浓度的Na^(+)、K^(+)和Ba^(2+)对胞外分泌蛋白的DNase活性均无明显影响;不同浓度的Ca^(2+)、Mg^(2+)和Mn^(2+)可提高胞外分泌蛋白的DNase活性;1 mmol/L和5 mmol/L的Co^(2+)以及0.01 mmol/L和0.1 mmol/L的Cu^(2+)则可抑制该蛋白的DNase活性,而1 mmol/L和5 mmol/L的Cu^(2+)则对该蛋白的DNase活性无明显影响。本研究首次证实了禽Pm C48-1株胞外分泌蛋白的DNase活性,且该活性具有广谱性,并明确了影响该活性的因素,为进一步探究胞外DNase在Pm感染及与宿主互作中的作用提供参考。

关键词：多杀性巴氏杆菌 C48-1株分泌蛋白 DNase 胞外核酸酶

牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株的构建及其在小鼠上的交叉保护性分析

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畜牧兽医学报 2022年第10期53卷 3582-3597页

作者：杨洋谢黎卿胡沛高丽旭袁祥李攀彭远义李能章西南大学动物医学院重庆400715

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株(PmCQ2)的hyaD基因缺失株(ΔhyaD)。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD... 详细信息

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株(PmCQ2)的hyaD基因缺失株(ΔhyaD)。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD的荚膜产生量及其感染后在脏器中的细菌定殖量均显著下降,其毒力显著降低。细胞试验发现,ΔhyaD更易黏附于巨噬细胞,被吞噬数量显著多于野生株,致使巨噬细胞相关炎性因子表达显著上调。hyaD基因的缺失,可调控与荚膜合成、LPS合成转运、铁转运等相关的基因表达显著下调,促使相关保护性抗原基因表达显著上调。以制备的PmCQ2株和ΔhyaD株灭活苗免疫小鼠(加强免疫1次),免疫后第21天分别采用同源和异源多杀性巴氏杆菌攻毒,ΔhyaD株免疫小鼠肺组织感染后24 h无明显或轻微病理损伤,对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为100%、100%和80%,对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为90%、100%、100%;而野生株PmCQ2除对牛源A型多杀性巴氏杆菌的保护率在80%以上外,对牛源B型和F型及兔、猪、禽源A型多杀性巴氏杆菌均无明显交叉保护作用。研究结果表明,hyaD基因可通过调控荚膜产生及毒力相关因子表达影响菌株毒力;hyaD基因缺失可调控相关交叉保护性抗原表达,赋予菌株交叉免疫保护特性。该研究为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了参考。

关键词：多杀性巴氏杆菌 hyaD 基因缺失株毒力交叉保护性

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

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畜牧兽医学报 2005年第6期36卷 590-595页

作者：唐先春吴斌索绪峰王大林陈焕春尹争艳华中农业大学动物病原微生物实验室武汉430070 海口市美兰区罗牛山兽医站海南571133

用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66 株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)。然后做了药敏试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒... 详细信息

用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66 株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)。然后做了药敏试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致;PCR分型表明有46株为D型Pm,18株为A型Pm,1株为B型Pm,1株无法定型;有8株用PCR检测为T+ Pm;豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8 株T+ Pm都为D型,都分离于有严重PAR症状的猪。

关键词：多杀性巴氏杆菌特性研究分离鉴定生物学 PCR方法猪生化鉴定致死试验萎缩性鼻炎 PCR鉴定 PcR检测药敏试验毒素基因 Pm 进行性症状 PAR 分型小鼠坏死皮肤豚鼠 D型肺脏肺炎

猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2014年第12期36卷 957-960页

作者：孙建华蒋惠婷朱玉欣刘嘉静樊宵云高远倪宏波黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为建立猪多杀性巴氏杆菌(Pm)的快速检测方法,本研究以Pm的Plp B基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了Pm特异性的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。经反应条件优化,确定反应条件为63℃,20 min。检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有... 详细信息

为建立猪多杀性巴氏杆菌(Pm)的快速检测方法,本研究以Pm的Plp B基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了Pm特异性的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。经反应条件优化,确定反应条件为63℃,20 min。检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性,灵敏度为25 cfu/m L;与大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌无任何交叉反应。采用建立的LAMP方法与常规PCR方法对临床54份分离样品进行检测,检测结果为31份为阳性,23份为阴性,二者符合率为100%。该方法的建立为Pm在临床上的快速检测提供了一种新的技术手段。

关键词：环介导等温扩增多杀性巴氏杆菌 PlpB 检测

禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)成熟外膜蛋白H基因原核表达最适条件的探索

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中国兽医科技 2005年第1期35卷 45-48页

作者：曹素芳黄青云韩先干邓宪方华南农业大学兽医学院广东广州510642

应用PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌C48 1成熟外膜蛋白H基因(ompmH),将ompmH片段按正确的阅读框定向插入原核表达载体pGEX 6p 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,获得了重组表达质粒pGEX ompmH。然后将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),... 详细信息

应用PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌C48 1成熟外膜蛋白H基因(ompmH),将ompmH片段按正确的阅读框定向插入原核表达载体pGEX 6p 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,获得了重组表达质粒pGEX ompmH。然后将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),当转化菌的D600nm值达到0.6～0.8时,对异丙基硫代 β D 半乳糖苷(IPTG)的诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行了试验,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳判定融合蛋白GST ompmH表达的最适条件。结果,当细菌的D600nm值为0.6～0.8时,IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol L,最佳诱导时间为4h,最适诱导温度为25℃。并用免疫印迹法对表达产物进行检测,结果显示表达的融合蛋白GST ompmH能与C48 1外膜蛋白免疫血清发生特异性反应,证明pGEX 6p 1载体表达的融合蛋白保留了天然蛋白的抗原性。

关键词：禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H基因聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法融合蛋白

猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的原核表达及其免疫保护性的研究

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中国兽医科学 2015年第6期45卷 584-588页

作者：郝杰赵墩刘崇灵黄婕峰余兴龙湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

为研究猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌全基因组中的PlpP基因序列,对目的基因进行PCR扩增,并将PCR片段克隆至载体pET-28a(+)中,再将重组表达质粒pETPlpP转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行... 详细信息

为研究猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌全基因组中的PlpP基因序列,对目的基因进行PCR扩增,并将PCR片段克隆至载体pET-28a(+)中,再将重组表达质粒pETPlpP转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。序列分析表明,得到了1条大小为945bp的基因片段,与预期大小相符。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在BL21(DE3)中表达,表达产物为分子质量约45ku的融合蛋白。将纯化的重组蛋白pETPlpP制备成亚单位疫苗,并经皮下途径免疫小鼠,二免后第2周均以5LD50的A、B和D这3种荚膜抗原血清型的多杀性巴氏杆菌分别对小鼠进行攻毒,结果显示,A、B和D这3种血清型的保护率分别是16.67%、33.33%和66.67%。上述结果说明PlpP蛋白具有一定的免疫保护性。

关键词：多杀性巴氏杆菌 PlpP基因原核表达抗原性