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稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定

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生物工程学报 2023年第4期39卷 1773-1788页

作者：刘阳常俊彦王悦杨盼马彩云刘高峰郭俣刘长青王春景蚌埠医学院生命科学学院安徽蚌埠233000 蚌埠医学院检验医学院安徽蚌埠233000

创建能稳定合成多巴胺(dopamine,DA)递质的三转基因(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)的骨髓间充质干细胞系(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),移植至帕金森大鼠模型脑内,为帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的临床治疗提供实验依据。通过三转基因的重组慢病毒创建能稳定合成并分泌DA递质的DA-BMSCs稳定转染细胞系,利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光等技术检测BMSCs中三转基因(TH/DDC/GCH1)的表达,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测DA的合成情况。染色体G-带法检测DA-BMSCs的遗传稳定性。将DA-BMSCs移植于6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)偏侧损毁帕金森大鼠模型右脑的前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)区,检测其在PD大鼠脑内微环境中的存活、分化情况。阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验检测DA-BMSCs移植后PD大鼠的运动障碍改善情况。DA-BMSCs细胞系中TH/DDC/GCH1三转基因均能够稳定高效表达,而正常BMSCs对照组中均不表达。三转基因感染组(DA-BMSCs)和LV-TH感染组细胞培养上清液中DA浓度极其显著高于BMSCs空白对照组(P<0.0001)。传代后的DA-BMSCs仍能稳定合成DA,并保持正常二倍体核型(94.5%)。DA-BMSCs移植PD大鼠脑内4周后,显著改善PD大鼠模型的运动障碍,在脑内微环境中大量存活,分化为TH+和GFAP+细胞,并显著上调脑移植区域的DA水平。本研究成功创建了能稳定分泌DA,在大鼠脑中大量存活并分化的三转基因DA-BMSCs细胞系,为DA-BMSCs工程化培养与移植治疗PD奠定基础。

关键词：帕金森病大鼠间充质干细胞酪氨酸羟化酶多巴胺脱羧酶 GTP环化水解酶1 多巴胺

1个芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症家系的遗传学诊断

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中国优生与遗传杂志 2024年第6期32卷 1276-1278页

作者：张晓黄铭燕颜俊何韵杰颜钰莹曾健厦门大学医学院(中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院)基础医学实验室/福建省移植生物学重点实验室福建福州350025

目的对1个芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADCD)家系进行基因诊断,为该家系临床治疗及产前诊断提供理论依据。方法采集患儿及其家系成员外周血行淋巴细胞染色体G显带分析,提取基因组DNA,运用单核苷酸多态性微阵列技术(SNP-array)进行全基... 详细信息

目的对1个芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADCD)家系进行基因诊断,为该家系临床治疗及产前诊断提供理论依据。方法采集患儿及其家系成员外周血行淋巴细胞染色体G显带分析,提取基因组DNA,运用单核苷酸多态性微阵列技术(SNP-array)进行全基因组拷贝数变异分析,通过全外显子组测序(WES)分析技术对先证者进行致病基因突变分析,并用Sanger测序对患儿及其家系成员样本的突变位点进行验证。结果染色体核型分析及SNP-array均未发现异常;WES结果提示先证者的DDC基因存在IVS 6+4A>T纯合突变,Sanger测序结果显示先证者胞兄存在相同的纯合突变,其父母均为DDC基因IVS 6+4A>T杂合突变携带者。结论在1个AADCD家系中发现了1个DDC基因突变,即IVS 6+4A>T,这为该家系成员提供了明确的分子遗传学诊断,为临床治疗和下次生育策略提供依据。

关键词：芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症神经递质代谢疾病多巴胺脱羧酶全外显子组测序

过表达DDC,TH和GCH1重组慢病毒构建及其在帕金森大鼠模型治疗作用的探究

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过表达DDC,TH和GCH1重组慢病毒构建及其在帕金森大鼠模型治疗作用...

作者：赵慧慧南京医科大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常见的神经系统退行性疾病,随着年龄增加,其发病率逐渐增高。PD主要病理改变是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)内多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少,从而导致Snc-纹状体通路... 详细信息

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常见的神经系统退行性疾病,随着年龄增加,其发病率逐渐增高。PD主要病理改变是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)内多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少,从而导致Snc-纹状体通路中DA释放减少。PD病因和致病机制目前尚不清楚,其并非单一因素所致,而是年龄、环境、遗传等因素交互作用的结果。目前临床上无药物能够减缓阻止及逆转DA能神经元变性过程。无论是药物治疗,还是手术治疗,都不能根治PD,且会产生明显副作用。PD主要病变是Snc部DA能神经元丢失导致纹状体内DA水平下降,且PD患者脑中病变部位明确,因此PD成为神经系统病变中进行基因治疗热门病种。本文中,通过构建过表达多巴胺脱羧酶(dopamine decarboxylase,DDC)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)环化水解酶(GTP cyclihydrolase1,GCH1)的重组慢病毒(recombinant lentivirus,rLV),将DDC+TH+GCH1-rLV注射至6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备的PD模型大鼠纹状体中,观察病毒在PD大鼠脑内的表达情况及大鼠的旋转行为学改变。采用携带产酶基因重组病毒载体,在动物模型中进行治疗,拟重建纹状体DA水平,以期待达到预期治疗效果。第一部分过表达DDC,TH和GCH1 rLV及对照rLV制备及鉴定目的构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV载体。方法PCR扩增各目的基因片段DDC、SV40 early promoter、TH、mPGK promoter、GCH1,使用BamHI-HF和XhoI对载体pMT174(pLV-RSV-CMV-WPRE)进行酶切,回收载体片段备用。进而在无缝反应液作用下,将各目的片段与回收后的线性化表达载体进行同源重组。利用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序,测序无误后进行质粒提抽。最后目的质粒与辅助质粒pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G共转染HEK293T细胞进行病毒包装,经纯化、浓缩后保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定。取出DDC+TH+GCH-rLV及对照rLV冰上融化,感染HEK293T细胞。72 h后,提取总蛋白,对DDC、TH、GCH1进行Western blot检测。结果PCR结果显示,在1429 bp、412 bp、1614 bp、551 bp、791 bp处可见特异性目的基因DDC,SV40 early promoter,TH,mPGK promoter,GCH1目的基因条带;使用BamHI-HF和XhoI对工具载体pMT174进行酶切,回收6508 bp载体片段;菌落PCR转化子鉴定结果显示,阳性克隆得到1436 bp片段;测序结果正确;与辅助质粒共转染HEK293T细胞,72小时后获得DDC+TH+GCH1-rLV和对照rLV颗粒,经过纯化浓缩后-80℃保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定,分别为5.56×10 v·g·mL、1.07×10 v·g·mL。Western blot结果可见,DDC+TH+GCH1-rLV感染组在3种DDC、TH和GCH1蛋白相对分子质量处可见特异性的蛋白分子表达条带。结论成功构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV,其浓度及所携带基因功能满足后续实验需要。第二部分过表达DDC,TH和GCH1 rLV在PD大鼠模型中的作用探究目的评价DDC+TH+GCH1-rLV对PD大鼠模型的治疗效果,检测目的基因是否正确表达。方法大鼠6-OHDA MFB两点法立体注射,构造单侧损毁PD模型。挑选完全损伤模型,其标准为旋转圈数每分钟>7圈,或30分钟>210圈。运用Snc部TH免疫荧光,检测PD大鼠DA能神经元损毁情况。24只PD大鼠模型分为随机分为三组:生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体三点注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果6-OHDA MFB两点法立体注射构建PD大鼠模型,符合PD大鼠旋转行为标准,挑选PD模型大鼠。PD大鼠Snc部TH免疫荧光结果显示:损毁侧DA能神经元大量丢失(P<0.01),行为学观察及免疫荧光检测证明PD模型构建成功。PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(

关键词：帕金森病多巴胺脱羧酶酪氨酸羟化酶三磷酸鸟苷环化水解酶1 重组慢病毒基因治疗高效液相色谱-串联质谱联用法

钙敏感受器（CaSR）对嗜铬细胞瘤中儿茶酚胺合成和肿瘤进展的潜在作用

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钙敏感受器（CaSR）对嗜铬细胞瘤中儿茶酚胺合成和肿瘤进展的潜在...

作者：李运阔吉林大学

学位级别：硕士

肾上腺髓质细胞属于神经内分泌细胞，当交感神经兴奋时，通过钙离子的内流调控儿茶酚胺的合成与分泌。病理状态下的嗜铬细胞通过自主合成及分泌儿茶酚胺，导致体内儿茶酚胺水平异常升高，临床上以阵发性高血压、心律失常等为主要表现。2... 详细信息

肾上腺髓质细胞属于神经内分泌细胞，当交感神经兴奋时，通过钙离子的内流调控儿茶酚胺的合成与分泌。病理状态下的嗜铬细胞通过自主合成及分泌儿茶酚胺，导致体内儿茶酚胺水平异常升高，临床上以阵发性高血压、心律失常等为主要表现。2017年WHO将嗜铬细胞瘤（PHEO）定义为来源于肾上腺髓质嗜铬细胞的肿瘤，却没有定义恶性嗜铬细胞瘤。但现在的观点认为所有嗜铬细胞瘤均具有转移潜能，约10%的嗜铬细胞瘤发生转移。然而仅靠病理学特征或免疫组织化学的方法很难判断嗜铬细胞瘤的转移潜能。最近有研究指出一些免疫组织化学标志物可以辅助恶性嗜铬细胞瘤的诊断，例如S100、Ki67、SDHB、P53等，但迄今为止仍没有任何肿瘤标志物可以完全准确的对恶性嗜铬细胞瘤进行诊断。因此探究恶性嗜铬细胞瘤的诊断依据是目前该领域研究的重要方向。　　钙敏感受体（CaSR）最早被发现于甲状旁腺细胞，通过感受细胞外钙离子浓度来调控甲状旁腺激素的合成和血钙水平，属于G蛋白偶联受体家族的一员。随着对CaSR研究水平的提升，CaSR被发现在体内多种细胞内（如肾脏、骨、小肠等）表达，并成为在多种组织环境中协调钙稳态和信号的关键。CaSR通过其下游信号（cAMP、PKA等）在许多内分泌功能及细胞增殖调控中起着关键作用，相关研究表明其机制与儿茶酚胺合成及嗜铬细胞增殖的调控有一定的共性，因此我们推测CaSR可能参与儿茶酚胺的合成和PHEO的发病机制。　　由于CaSR在肾上腺髓质细胞中的作用尚未被探究，因此在这项研究中，我们通过分析CaSR在正常肾上腺髓质及嗜铬细胞瘤中的表达模式，及其与儿茶酚胺合成的相关性，探究CaSR在嗜铬细胞中儿茶酚胺合成及肿瘤进展的潜在作用，进而对肾上腺嗜铬细胞瘤的诊断、预后判断、治疗提供新思路。　　目的：　　探究CaSR在嗜铬细胞中儿茶酚胺合成及其肿瘤进展的潜在作用，并探讨其可能相关的分子机制　　方法：　　1.探究CaSR在不同肾上腺组织中的表达水平　　（1）通过对84例正常肾上腺髓质、PHEO和恶性PHEO进行CaSR免疫组化染色，并分析CaSR在三者中表达的差异性。　　（2）通过TCGA和GEO数据库对正常肾上腺和PHEO中CaSR的mRNA和蛋白水平进行多人种双数据库验证。　　2.探究CaSR表达与儿茶酚胺合成酶的相关性　　（1）通过对42例PHEO组织标本进行免疫组化染色，检测酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺脱羧酶（DDC）、多巴胺β-羟化酶（DBH）和酚胺-N-甲基转移酶（PNMT）的表达水平，并与CaSR表达进行相关性分析。　　（2）通过对28例正常肾上腺组织进行免疫组化染色，检测TH,DDC,DBH和PNMT的表达水平，并与CaSR表达进行相关性分析。　　3.探究CaSR表达与PHEO相关肿瘤标记物的相关性　　（1）通过42例PHEO组织标本进行免疫组化染色，检测细胞增殖标记物Ki-67、S100蛋白、铬粒蛋白A（CgA）和p53的表达水平，并与CaSR进行相关性分析。　　4.探究CaSR表达与PHEO临床数据的相关性　　（1）收集42例PHEO患者的临床数据，包括患者的年龄、性别、肿瘤特征、血压、血清电解质浓度等，与CaSR表达进行相关性分析。　　5.探究CaSR表达与肾上腺嗜铬细胞瘤量化评分（PASS）中高危因素的相关性　　（1）通过对42例PHEO组织形态学高危因素的量化，与CaSR免疫组化表达进行相关性分析。　　结果：　　***在不同肾上腺组织中的表达水平　　（1）通过84例正常肾上腺髓质和PHEO病例的免疫组化统计分析，在正常肾上腺髓质，PHEO和恶性PHEO三者中，CaSR的表达水平逐级递减，即正常肾上腺髓质中最高，恶性PHEO中最低。且与PHEO和恶性PHEO相比，正常肾上腺髓质中CaSR的水平最高（plt;0.0001）。与恶性病例相比，PHEO中的CaSR的水平显著更高（plt;0.0001）。　　（2）TCGA和GEO数据库证明，在白种人和黑种人之中，正常肾上腺中CaSR的mRNA和蛋白水平比PHEO中CaSR的mRNA和蛋白水平显著升高。　　***表达与儿茶酚胺合成酶的相关性　　（1）通过42例PHEO病例的免疫组化显示，CaSR的表达水平与TH（p=0.0176，ρ=0.3646）和DDC（p=0.0066，ρ=0.4130）都表现出显著且正相关。相反，没有发现CaSR的表达水平与DBH或PNMT之间有显著的相关性。　　（2）通过28例正常肾上腺的免疫组化显示，CaSR的表达水平与DDC显示出显著且正相关（p=0.0293，ρ=0.4277）。然而，没有发现CaSR的表达水平与TH、DBH或PNMT之间没有显著的相关性。　　***表达与PHEO相关肿瘤标记物的相关性　　（1）通过42例PHEO病例的免疫组化，发现CaSR

关键词：嗜铬细胞瘤儿茶酚胺钙敏感受器酪氨酸羟化酶多巴胺脱羧酶

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多巴胺在术后肠粘连中的作用研究

多巴胺在术后肠粘连中的作用研究

作者：龚土平泸州医学院

学位级别：硕士

目的：(1)、制作SD大鼠肠粘连模型，通过免疫组化的方法检测术后第2、5、8天酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、多巴胺脱羧酶（Dopamine Decarboxylase,DDC）、多巴胺D2受体（DopamineD2Receptor DAD2R）在盲肠的表达,探讨多巴... 详细信息

目的：(1)、制作SD大鼠肠粘连模型，通过免疫组化的方法检测术后第2、5、8天酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、多巴胺脱羧酶（Dopamine Decarboxylase,DDC）、多巴胺D2受体（DopamineD2Receptor DAD2R）在盲肠的表达,探讨多巴胺与术后肠粘连的关系。（2）、通过分别抑制SD大鼠肠粘连模型术后的炎症反应及多巴胺的作用，观察多巴胺与炎症介质之间的相互作用，探讨多巴胺在术后肠粘连形成中的作用机制。方法：该实验研究分两部分：（1）、选取SD雄性大鼠96只，随机分为3组：正常对照组（n=14），假手术组（n=42），肠粘连模型组（n=42）。正常对照组不予处理，假手术组行单纯开关腹手术，模型组采用Ellis法制备肠粘连模型。假手术组及模型组分别在术后第2、5、8天分批处死，每次每组各14只，正常组动物饲养3天后一次性全部处死，动物处死之前禁食12小时。动物处死后取盲肠，经固定、包埋后行免疫组化染色。利用IPP5.1软件进行图像分析，以平均光密度值（OD值）代表各组TH、DDC、DAD2R的表达。应用软件spss17.0进行统计学分析，通过单因素方差分析检验各组间差异性，P多巴胺及其受体参与了术后早期肠粘连的形成。（2）、在术后肠粘连形成过程中，多巴胺与炎症相互作用，一方面炎症反应增加了胃肠道多巴胺及其受体表达,进而影响胃肠道活动度;另一方面多巴胺增加了炎症介质表达;它们相互影响共同参与了术后肠粘连的形成。

关键词：多巴胺炎症酪氨酸羟化酶多巴胺脱羧酶多巴胺D2受体转化生长因子-β1 肿瘤坏死因子-α 前列腺素E2 白细胞

胃癌开腹手术与腹腔镜手术的腹腔灌洗结果分析

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中国民间疗法 2021年第3期29卷 102-103,125页

作者：武明山西省运城市中心医院山西运城044000

目的:分析胃癌开腹手术与腹腔镜手术的腹腔灌洗结果。方法:选取胃癌患者84例,随机分为对照组和研究组,每组42例。对照组行开腹手术,研究组行腹腔镜手术。比较两组患者围术期指标(切口长度、手术用时、淋巴结清扫数量、术中失血量、术后... 详细信息

目的:分析胃癌开腹手术与腹腔镜手术的腹腔灌洗结果。方法:选取胃癌患者84例,随机分为对照组和研究组,每组42例。对照组行开腹手术,研究组行腹腔镜手术。比较两组患者围术期指标(切口长度、手术用时、淋巴结清扫数量、术中失血量、术后住院时间)、腹腔冲洗液细胞学(PLC)、术后并发症发生情况。结果:研究组切口长度、术后住院时间短于对照组(P0.05);两组患者术后PLC阳性率均高于术前(P<0.05),但研究组低于对照组(P<0.05)。结论:腹腔镜手术治疗胃癌效果、安全性与开腹手术相当,但前者创伤更小、恢复更快且术后发生微转移率更低。

关键词：胃癌腹腔镜手术开腹手术多巴胺脱羧酶癌胚抗原

进展期胃癌行腹腔镜胃癌根治术对腹腔冲洗液 CEA、DDC浓度和炎性因子的影响

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医学理论与实践 2019年第23期32卷 3784-3786页

作者：汤朝辉湖北省竹溪县中医院普外科

目的:探究腹腔镜根治术治疗进展期胃癌的效果及对腹腔冲洗液癌胚抗原(CEA)、多巴胺脱羧酶(DDC)及炎性因子的影响。方法:选取2015年2月-2018年2月本院收治的进展期胃癌患者185例,按随机数表法分为研究组(腹腔镜根治术,96例)、对照组(开... 详细信息

目的:探究腹腔镜根治术治疗进展期胃癌的效果及对腹腔冲洗液癌胚抗原(CEA)、多巴胺脱羧酶(DDC)及炎性因子的影响。方法:选取2015年2月-2018年2月本院收治的进展期胃癌患者185例,按随机数表法分为研究组(腹腔镜根治术,96例)、对照组(开腹根治术,89例)。观察两组治疗情况及效果、肿瘤微转移指标(腹腔冲洗液CEA、DDC)、炎性因子[C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)]水平。结果:两组手术时间、淋巴结清扫数差异无统计学意义(P>0.05);研究组术中出血量、术后胃肠功能恢复时间、肛门排气时间、住院时间均少于对照组(P0.05);手术结束研究组腹腔冲洗液CEA、DDC均低于对照组(P0.05);术后7d研究组的CRP、IL-6水平低于对照组,IL-10水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腹腔镜根治术治疗进展期胃癌效果确切,可相对降低肿瘤微转移风险,减轻炎性反应,促进胃肠功能及术后恢复。

关键词：进展期胃癌腹腔镜胃癌根治术癌胚抗原多巴胺脱羧酶炎性因子