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用于植物多基因表达载体构建的质粒系统

分子植物育种 2018年第4期16卷 1138-1146页

作者：陈任张虹张芮虎娟周涛安韶雅林哲宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室银川750021 宁夏大学生命科学学院银川750021

为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒由于酶切位点有限,目的基因片段难于插入,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子和筛选标记等功能元件,无法构建多个基因表达载体等缺点,本研究通过对大肠杆菌(Escherichia coli)质粒p UC1... 详细信息

为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒由于酶切位点有限,目的基因片段难于插入,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子和筛选标记等功能元件,无法构建多个基因表达载体等缺点,本研究通过对大肠杆菌(Escherichia coli)质粒p UC18和双核农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumer inducing)质粒p BI121进行改造,建立了一套适用于植物基因表达载体构建的质粒系统,即重组质粒p KAFCR80和p KAFCR100。p KAFCR80具有植物基因表达最常用的CAMV 35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(Nopaline synthase terminator),并在其上游、中间和下游引入了多个克隆酶切位点,利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可以多种方式连接到35S启动子与NOS终止子之间;p KAFCR100具有卡那霉素NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)耐性基因和s GFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,以及其中间的多克隆酶切位点。p KAFCR80与p KAFCR100两个质粒的配合使用,可以方便地构建植物单个或多个基因表达载体。本研究以PCR扩增的甜叶菊葡萄糖基转移酶三个基因为材料,利用该质粒系统以单独和组合形式成功地构建了植物表达载体,验证了该系统的实用性。

关键词：载体构建质粒系统多基因表达载体新方法甜叶菊葡萄糖基转移酶基因

文昌鱼中一个2A肽介导的多基因表达载体构建

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厦门大学学报（自然科学版） 2018年第1期57卷 44-49页

作者：华俊豪李光王义权厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室福建厦门361102

2A肽(P2A)介导的多基因表达载体具有高裂解活性且上、下游基因等摩尔表达等优点,已广泛应用于动物转基因研究.文昌鱼(amphioxus)作为一种新兴的模式动物,尚无应用这种表达载体的报道,为此在pXT7转录系统基础上构建一个P2A介导的多基因... 详细信息

2A肽(P2A)介导的多基因表达载体具有高裂解活性且上、下游基因等摩尔表达等优点,已广泛应用于动物转基因研究.文昌鱼(amphioxus)作为一种新兴的模式动物,尚无应用这种表达载体的报道,为此在pXT7转录系统基础上构建一个P2A介导的多基因表达载体.将体外转录的P2A介导的mRNA注入文昌鱼卵细胞并受精后,经激光共聚焦显微镜和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测表明,该mRNA在文昌鱼胚胎中能够高效地翻译和剪切,并且在信号肽的作用下eGFP蛋白定位于细胞核中,而mCherry蛋白定位于细胞膜上,上、下游蛋白间的剪切效率达到91%;进而构建了由文昌鱼热激蛋白基因启动子(BbHsp70)启动,并由P2A介导的多基因表达载体,实验证明其在热诱导和上、下游蛋白剪切方面均达到了预期效果.

关键词：多基因表达载体 2A肽热激启动子共表达文昌鱼

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脂肪酸合成酶系多基因表达载体的构建

中国老年学杂志 2013年第17期33卷 4178-4180页

作者：汪坤福朱贵明张莉张涛荆鑫鑫江旭东王明富佳木斯大学黑龙江佳木斯154007

目的利用独立表达盒法构建脂肪酸去饱和酶基因和延长酶基因的四基因表达载体进一步研究多基因表达载体中各个基因表达的相互影响。方法利用基因工程的方法扩增2个脂肪酸去饱和酶基因和2个延长酶基因,然后连接到pcDNA3.1(-)哺乳动物表达... 详细信息

目的利用独立表达盒法构建脂肪酸去饱和酶基因和延长酶基因的四基因表达载体进一步研究多基因表达载体中各个基因表达的相互影响。方法利用基因工程的方法扩增2个脂肪酸去饱和酶基因和2个延长酶基因,然后连接到pcDNA3.1(-)哺乳动物表达载体上,之后转化、筛选、酶切鉴定。最后脂质体法瞬时转染HK293T细胞,提取RNA检测这四个基因的表达情况。结果成功构建了含脂肪去饱和酶基因和延长酶基因的四基因表达载体pcDNA3.1-EF,并在HK293T细胞中成功表达。结论四基因表达载体pcDNA3.1-EF在HK293T细胞中成功表达,单个基因在表达载体中的次序对基因的表达没有明显影响。

关键词：多不饱和脂肪酸多基因表达载体脂肪酸去饱和酶脂肪酸延长酶

豆科共生关键基因表达载体的构建及其功能互补分析

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中国科技论文 2016年第24期11卷 2806-2810页

作者：李豪梅江鹏张忠明华中农业大学生命科学技术学院武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

利用生物工程技术扩大根瘤菌宿主范围、提高固氮效率,实现非豆科植物共生固氮一直是生物固氮研究的热点。将豆科植物百脉根与根瘤菌共生信号通路的9个关键基因分别置于不同根组织强表达启动子下,构建了5个用于转化水稻的多基因表达载体... 详细信息

利用生物工程技术扩大根瘤菌宿主范围、提高固氮效率,实现非豆科植物共生固氮一直是生物固氮研究的热点。将豆科植物百脉根与根瘤菌共生信号通路的9个关键基因分别置于不同根组织强表达启动子下,构建了5个用于转化水稻的多基因表达载体。通过毛根转化互补豆科植物突变体,结果表明,这些基因大多数都能互补百脉根或苜蓿相应基因突变体,即多基因表达载体可用于水稻稳定转化,在水稻中搭建1条与根瘤菌共生的基因线路,为探索构建水稻共生固氮体系提供理论和技术支撑。

关键词：微生物学生物固氮共生基因多基因表达载体百脉根水稻

基于Cre/loxP重组系统的多基因载体构建及烟草转化研究

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北京林业大学学报 2010年第5期32卷 121-125页

作者：贾香楠李伟沈俊岭欧阳昆唏陈晓阳北京林业大学林木育种国家工程实验室华南农业大学林学院

利用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转... 详细信息

利用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR和Southern blot检测发现,多基因已成功转入烟草基因组中;经半定量RT-PCR检测证实,4个基因均能正常表达。

关键词： Cre/loxP重组系统多基因表达载体 BtCrylAc基因 BADH基因 pttGA200x基因 rolB基因

利用TAC系统构建多个光合同化物运输蛋白基因转化载体和水稻的遗传转化

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福建农业学报 2010年第1期25卷 1-7页

作者：苏军林美坤杜琳洪海强王锋福建省农业科学院农业遗传工程重点实验室福建福州350003

采用人工染色体(TAC)多基因组装载体系统,将一组与水稻光合同化物运输转化有关基因构建在同一载体上,这些基因分别是蔗糖转运蛋白基因(OsSUT5),单糖转运蛋白(OsMST4)、细胞壁转化酶(OsCIN3)和ATP/ADP转运蛋白(OAAT),获得了包含这4个基... 详细信息

采用人工染色体(TAC)多基因组装载体系统,将一组与水稻光合同化物运输转化有关基因构建在同一载体上,这些基因分别是蔗糖转运蛋白基因(OsSUT5),单糖转运蛋白(OsMST4)、细胞壁转化酶(OsCIN3)和ATP/ADP转运蛋白(OAAT),获得了包含这4个基因的植物表达载体pTAC747H-OAAT-SUT5-CIN3-MST4,质粒大小近30 kb。通过农杆菌转化法,将基因导入水稻,以探讨这些基因对水稻光合同化物运输和转化的调控作用。

关键词：水稻多基因表达载体遗传转化

四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的超表达提高长链多不饱和脂肪酸生物合成效率

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生物工程学报 2014年第9期30卷 1464-1472页

作者：朱贵明 Abdulmomen Ali Mohammed Saleh Said Ahmed Bahwal 汪坤福王明富王迪迪葛堂栋孙洁佳木斯大学基础医学院黑龙江佳木斯154007

DHA(22:6n-3)、EPA(20:5n-3)和ARA(20:4n-6)三种长链多不饱和脂肪酸在生物体内活性最强,它们在促进大脑发育和功能维持以及在预防和治疗心血管疾病、炎症、癌症等多种疾病方面有着重要作用。然而,尽管哺乳动物体内有完整的长链多不饱和... 详细信息

DHA(22:6n-3)、EPA(20:5n-3)和ARA(20:4n-6)三种长链多不饱和脂肪酸在生物体内活性最强,它们在促进大脑发育和功能维持以及在预防和治疗心血管疾病、炎症、癌症等多种疾病方面有着重要作用。然而,尽管哺乳动物体内有完整的长链多不饱和脂肪酸合成酶系,但哺乳动物合成这些长链多不饱和脂肪酸的效率很低而主要依赖于食物获取。本研究应用转基因方法,将哺乳动物来源的Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶这4种酶的编码基因构建成为一个多基因表达载体,然后转染哺乳动物细胞HEK293T,实现了4个目的基因的超表达,再通过气质联用(GC-MS)分析证实了DHA、EPA和ARA等长链多不饱和脂肪酸的合成效率及水平显著增加,DHA的水平更是提高了2.5倍。由此可见,哺乳动物具有某种抑制长链多不饱和脂肪酸高水平合成的机制,但通过Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的超表达,能够打破哺乳动物这种抑制机制,从而显著提高DHA、EPA、ARA等的合成水平。同时,本研究的思路也为在转基因动物中生产长链多不饱和脂肪酸提供了重要的启示。

关键词：多不饱和脂肪酸脂肪酸去饱和酶脂肪酸延长酶多基因表达载体

哺乳动物细胞多不饱和脂肪酸合成酶系的重建将亚油酸代谢转变为二十二碳六烯酸

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生物工程学报 2015年第2期31卷 281-290页

作者：朱贵明 Abdulmomen Ali Mohammed Saleh Said Ahmed Bahwal 邱立红孙洁商宇江旭东葛堂栋张涛佳木斯大学基础医学院黑龙江佳木斯154007

二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)是一种长度为22个碳原子且含有6个双键的ω-3系多不饱和脂肪酸,在人体中具有重要生物学功能。人体及其他哺乳动物体内只能合成少量的DHA,更多的需求必须从食物中获取。然而,DHA的天然资源(主要是深海鱼类等... 详细信息

二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)是一种长度为22个碳原子且含有6个双键的ω-3系多不饱和脂肪酸,在人体中具有重要生物学功能。人体及其他哺乳动物体内只能合成少量的DHA,更多的需求必须从食物中获取。然而,DHA的天然资源(主要是深海鱼类等海洋产品)日趋枯竭,开发新型资源以满足不断扩大的市场需求势在必行。本研究利用转基因技术,在哺乳动物细胞中使Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶超表达,同时表达来源于秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的Δ15去饱和酶和小眼虫Euglena gracilis的Δ4去饱和酶,结果表明,这6种酶的表达或超表达能将ω-6系的亚油酸(LA,18:2n-6)有效地转化为DHA(22:6n-3),后者的含量从对照组的16.74%提高到实验组的25.3%。本研究的策略及技术路线为将来利用遗传改造的哺乳动物生产珍稀的DHA(22:6n-3)等长链多不饱和脂肪酸产品提供了重要的启示。

关键词：多不饱和脂肪酸脂肪酸去饱和酶脂肪酸延长酶多基因表达载体转基因

盐角草甜菜碱合成相关基因的共表达提高转基因烟草的耐盐性

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中国农学通报 2010年第9期26卷 55-59页

作者：胡艳梅苏乔祖勇刘纪文大连理工大学生物科学与工程系辽宁大连116024

植物在逆境下能合成甜菜碱,其中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)和胆碱单加氧酶(CMO)是甜菜碱合成过程中的关键酶。将盐角草SePEAMT基因、SeCMO基因以及烟草的核基质结合区序列(Mar)利用Cre/loxP重组系统构建到同一表达载体上,得到植物... 详细信息

植物在逆境下能合成甜菜碱,其中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)和胆碱单加氧酶(CMO)是甜菜碱合成过程中的关键酶。将盐角草SePEAMT基因、SeCMO基因以及烟草的核基质结合区序列(Mar)利用Cre/loxP重组系统构建到同一表达载体上,得到植物表达载体pYLTAC747N-Mar-SePEAMT-SeCMO-Mar。该载体用电击转化法转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR检测确定转基因植株。在含250mM NaCl的MS培养基上培养35天后,转基因植株生根而野生型植株不能生根;转基因烟草植株甜菜碱积累量显著高于野生型植株,约是野生型植株的5.6～7.7倍;转基因植株与野生型相比,相对电导率显著降低,叶绿素含量明显升高。以上结果表明共表达SePEAMT和SeCMO能有效提高烟草甜菜碱表达量从而提高烟草的耐盐性。

关键词：甜菜碱耐盐 SePEAMT SeCMO 多基因表达载体