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遵义医科大学学报 2024年第5期47卷 513-521页

作者：肖飞郑宝英徐文健伏瑾黄小兰孙春荣贾楠张裕许峥周娟王毅首都儿科研究所实验中心北京100020 首都儿科研究所附属儿童医院呼吸科北京100020 首都儿科研究所附属儿童医院检验中心北京100020

目的建立一种简单、灵敏、快速的肺炎支原体(MP)检测方法,并对其应用性进行验证和评价。方法利用多交叉置换扩增(MCDA)技术对肺炎支原体特异基因CARDS毒素基因进行扩增,利用侧流免疫层析生物传感(LFB)技术读取扩增结果,命名该方法为MP-M... 详细信息

目的建立一种简单、灵敏、快速的肺炎支原体(MP)检测方法,并对其应用性进行验证和评价。方法利用多交叉置换扩增(MCDA)技术对肺炎支原体特异基因CARDS毒素基因进行扩增,利用侧流免疫层析生物传感(LFB)技术读取扩增结果,命名该方法为MP-MCDA-LFB。分析扩增反应在60~67℃(间隔1℃)的扩增效率,筛选最适反应温度;分析分别扩增10、20、30、40 min时能够检测到的最低核酸浓度,筛选最佳反应时间。利用10倍系列稀释的肺炎支原体核酸分析MP-MCDA-LFB方法的灵敏度和检测限,利用35株非肺炎支原体菌株分析MP-MCDA-LFB方法的特异性。利用MP-MCDA-LFB方法检测80份疑似MP感染的临床样本,并与RT-PCR法检测结果进行比较,分析MP-MCDA-LFB方法的临床应用性。结果MP-MCDA-LFB能够实现对肺炎支原体CARDS毒素基因的快速检测。其最佳反应温度为63℃,最短反应时间为40 min,整个检测过程可在1 h内。MP-MCDA-LFB方法具有较高的灵敏度和特异性,其检测限低至45 ng/L,与其他临床表现相似的病原体无交叉反应,特异性为100%。MP-MCDA-LFB方法从80份临床样本中检出45份阳性样本(56.3%),检出率与RT-PCR方法一致。结论本研究建立的以CARDS毒素基因为靶标的MP-MCDA-LFB检测方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优点,在基层医疗机构和现场检测具有较好的应用潜力。

关键词：肺炎支原体多交叉置换扩增技术侧流免疫层析生物传感技术 CARDS毒素基因 RT-PCR

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MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间选择及评估

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山东医药 2023年第9期63卷 41-45页

作者：韩文雅程雪琴刘群翔王骁肖传勇王梅芳十堰市太和医院呼吸与危重症医学科湖北十堰442000

目的筛选多交叉置换扩增技术(MCDA)结合纳米生物传感条(LFB)检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间,并对MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的效果进行评估。方法根据肺炎克雷伯菌特异的保守基因rcsA的核苷酸序列,采用Primer Premier V... 详细信息

目的筛选多交叉置换扩增技术(MCDA)结合纳米生物传感条(LFB)检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间,并对MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的效果进行评估。方法根据肺炎克雷伯菌特异的保守基因rcsA的核苷酸序列,采用Primer Premier Version 5.0软件设计一套特异性MCDA引物,其中交叉引物CP1和扩增引物C1分别标记异硫氰酸荧光素(FITC)和地高辛(Dig),建立25μL的MCDA反应体系。将温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃依次递增,分别扩增1 h,然后85℃加热5 min后终止反应,使用实时浊度仪观察DNA浓度曲线,绘制MCDA扩增反应动力学图,确定最佳扩增温度。在筛选出的最佳扩增温度下,选择10 min、20 min、30 min和40 min 4个时间点分别对10 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL的肺炎克雷伯菌DNA进行MCDA扩增,使用LFB进行检测,根据LFB检测结果确定最佳扩增时间。使用MCDA-LFB法检测36株肺炎克雷伯菌和18株非肺炎克雷伯菌,使用临床分离培养法和MCDA-LFB法检测呼吸道感染患者的42份痰液样本和3份健康对照痰液样本,观察MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的灵敏度、特异度。将肺炎克雷伯菌ATCC700603标准株基因组DNA分别稀释至10 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL,使用MCDA-LFB法检测,依据结果是否阳性判定检测下限。结果MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度为63℃,最佳扩增时间为30 min。MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的灵敏度、特异度均为100%。MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的检测下限为100 fg/μL。结论MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度为63℃,最佳扩增时间为30 min。MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的方法简单、快速、特异、灵敏,可以用于临床呼吸道标本中的肺炎克雷伯菌早期筛选。

关键词：多交叉置换扩增技术纳米生物传感条肺炎克雷伯菌病原菌检测 rcsA基因

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