检索结果-南通市图书馆

作者：殷倩倩中国农业科学院

学位级别：硕士

小反刍兽疫是(Peste des petits ruminants，PPR)由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminantsvirus，PPRV)引起的小反刍动物的一种接触性传染性疾病，发病率和死亡率分别可高达100%和90%。自1942年首次发现后，PPR传播迅速，给流行地... 详细信息

小反刍兽疫是(Peste des petits ruminants，PPR)由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminantsvirus，PPRV)引起的小反刍动物的一种接触性传染性疾病，发病率和死亡率分别可高达100%和90%。自1942年首次发现后，PPR传播迅速，给流行地区带来重大经济损失。该病无特效治疗方法，主要以疫苗免疫预防为主。目前广泛应用的PPR弱毒疫苗虽然具有良好的效果，但不能区分自然感染和疫苗免疫，干扰PPR的血清学监测。而标记疫苗(differentiate infected from vaccinatedanimals vaccine，DIVA疫苗)则可以弥补这一缺点，因此标记疫苗(DIVA疫苗)的研究具有重要的意义。 PPRV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，基因组为不分节段的负链RNA，其核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白是PPRV含量最丰富和免疫原性最强的结构蛋白，动物机体感染后可引起强烈的抗体反应进而产生高滴度抗体，该抗体虽不具有中和病毒的能力，但具有重要的诊断意义。因此N蛋白是引入外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。为构建小反刍兽疫标记疫苗，本研究以PPRV反向遗传操作系统为基础，分别构建了编码羧基端融合外源表位(HA表位、FLAG表位、小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19)N蛋白的融合基因NHA、N、N，并克隆至pCAGGS载体，以其替代PPRV反向遗传拯救系统中的表达天然PPRV N蛋白的辅助质粒后仍能够成功拯救出PPRV，几乎不影响病毒的拯救，表明融合外源表位后对N蛋白的功能影响较小。分别以NHA、N、N基因替换PPRV感染性克隆中的N基因，体外救获表达融合外源表位N蛋白的重组病毒rPPRV/GFP/HA、rPPRV/GFP/FLAG、rPPRV/GFP/5B19。Western blot和间接免疫荧光试验表明在重组病毒感染的Vero细胞中融合外源表位的N蛋白获得了正确表达。体外生长动力学试验分析表明重组病毒的生长最高滴度虽比亲本毒低，但具有满足疫苗使用滴度要求的可能。小鼠免疫试验结果显示，rPPRV/GFP/5B19首次免疫后5只小鼠中有3只小鼠检测到5B19特异性抗体，加强免疫后所有的小鼠都可检测到5B19特异性抗体;病毒中和试验结果显示rPPRV/GFP/5B19能够诱导较高的PPRV中和抗体水平，且与亲本毒rPPRV/GFP无显著差异(p>0.05)，表明该重组病毒具有成为标记疫苗的潜力。本研究为探索性试验，研究结果为小反刍兽疫标记疫苗的进一步研究奠定了基础。

关键词：小反刍兽疫病毒核蛋白外源表位标记疫苗

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Loop EF区嵌合猪细小病毒B细胞表位对猪圆环病毒2型病毒样颗粒组装的影响

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中国兽医科学 2019年第2期49卷 176-182页

作者：张素姣王东亮李萌蒋一凡湛洋王乃东湖南农业大学动物医学院兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室兽用疫苗逆向创制湖南省工程研究中心湖南长沙410128

Loop EF是猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的重要Loop结构,然而它在PCV2组装过程中的作用仍不清楚。本研究通过模拟PCV2病毒样颗粒(VLPs)3D结构,比较分析PCV2和PCV1、PCV3的氨基酸序列以及预测Loop EF的突变位点,筛选出PCV2 Loop EF中可供... 详细信息

Loop EF是猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的重要Loop结构,然而它在PCV2组装过程中的作用仍不清楚。本研究通过模拟PCV2病毒样颗粒(VLPs)3D结构,比较分析PCV2和PCV1、PCV3的氨基酸序列以及预测Loop EF的突变位点,筛选出PCV2 Loop EF中可供外源表位替换或插入的capsid表面位点,即第133位丙氨酸。探索性地针对该位点设计3个突变体,分别为猪细小病毒1型(PPV1)B细胞线性表位(228QQITDA233)插入PCV2 Cap第132和133位氨基酸、第133和134位氨基酸之间及替换第133位氨基酸。利用over-lap PCR等技术构建上述3个突变体的重组质粒,在大肠杆菌(BL21/DE3)中表达,并利用镍柱亲和层析纯化3个突变体蛋白,最后在体外进行VLPs组装,电镜结果显示3个突变体蛋白均可体外组装成完整的VLPs。结果表明,Loop EF中第133位丙氨酸的替换或插入外源表位突变不影响VLPs组装,提示PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性。

关键词：猪圆环病毒2型病毒样颗粒外源表位突变体蛋白

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PCV2 loops CD与EF展示PPV1 VP2 B细胞线性表位的结构与功能研究

PCV2 loops CD与EF展示PPV1 VP2 B细胞线性表位的结构与功能研究

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作者：张素姣湖南农业大学

学位级别：硕士

Loop CD和Loop EF是猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)衣壳(capsid,Cap)蛋白的重要loops结构,这些loops结构在病毒入侵、病毒与宿主细胞受体的相互作用以及随后的病毒内化等过程起到了关键性的作用。我们前期研究发现,Loop CD... 详细信息

Loop CD和Loop EF是猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)衣壳(capsid,Cap)蛋白的重要loops结构,这些loops结构在病毒入侵、病毒与宿主细胞受体的相互作用以及随后的病毒内化等过程起到了关键性的作用。我们前期研究发现,Loop CD可以展示外源性PRRSV GP5表位多肽,该表位插入不影响PCV2病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)的正常体外组装,且能够诱导小鼠机体同时产生针对PCV2 Cap和GP5表位多肽的特异性抗体。Loop EF是Cap蛋白中第二大loop结构,在PCV2 Cap组装过程中起重要作用,然而目前对Loop EF的功能知之甚少。因此,本文基于前期研究基础对PCV2 loops CD与EF展示猪细小病毒1型(Porcine parvovirus 1,PPV1)VP2 B细胞线性表位的结构与功能进行研究。(1)本研究首先通过常规分子克隆技术构建Loop CD插入PPV1 VP2 B细胞线性表位B5-E1(QQITDA)的重组质粒(Cap-M),随后重组质粒在大肠杆菌(BL21/DE3)中表达突变体蛋白,通过电镜和间接免疫荧光实验等证实嵌合表位B5-E1的突变体蛋白可以在体外自组装成嵌合型病毒样颗粒(chimeric Virus-like particles,cVLPs)。免疫试验结果显示,cVLPs能够诱导小鼠机体产生针对PCV2 Cap蛋白和B5-E1表位的特异性IgG抗体,提示Loop CD对不同外源表位多肽(PPV1 VP2表位和PRRS GP5表位)的插入不具有选择性,而且插入外源表位可展示在cVLPs表面。结果表明Loop CD区的GS氨基酸序列是PCV2 Cap蛋白组装的非必需氨基酸序列,而且具有展示不同外源抗原表位的能力。(2)基于PCV2 VLPs 3D结构模拟及PCV2、PCV1和PCV3的Cap氨基酸序列的比较分析,筛选发现Loop EF的VTKATALT位于Cap蛋白表面,该序列相对不保守。针对该区域设计了2个突变体,即将该氨基酸序列删除(Cap-M)以及B5-E1外源多肽表位替换该序列(Cap-M2),结果表明突变体蛋白和6×His标签均可在大肠杆菌(BL21/DE3)中正常表达,但是利用镍柱不能纯化目的突变蛋白。结果提示Loop EF VTKATALT可能是PCV2 Cap蛋白结构组装的必需氨基酸序列。(3)随后利用生物信息学软件预测和筛选PCV2 Loop EF中VTKATALT序列可能不参与Cap蛋白组装的候选位点,即第132位赖氨酸和第133位丙氨酸,并利用候选位点尝试在capsid表面替换或插入外源表位。首先针对第132位设计2个突变体(Cap-M和Cap-M),即将该位点突变成不带电的丙氨酸(A)及GSGS,并且以Cap-M重组质粒为模板,将132位赖氨酸替换成B5-E1外源多肽。然后针对第133位设计3个突变体,即B5-E1外源多肽插入PCV2 Cap第132和133位氨基酸、第133和134位氨基酸之间及替换第133位氨基酸。所有重组质粒在大肠杆菌(BL21/DE3)中表达,并利用镍柱亲和层析纯化突变体蛋白,最后在体外进行VLPs组装,电镜结果显示6个突变体蛋白均可体外组装成完整的VLPs。结果表明,Loop EF中第132位赖氨酸和第133位丙氨酸的替换或插入外源多肽不影响cVLPs组装,两个位点是PCV2Cap蛋白组装的非必需氨基酸,结果显示PCV2 VLPs单个Loop EF或者与Loop CD同时展示外源抗原表位具有可行性。鉴定Loops CD和EF区氨基酸突变对PCV2 VLPs表达及组装的影响,有助于揭示两者的结构与功能,也为PCV2组装机制研究奠定基础。本研究所形成的结果也为嵌合多种外源抗原表位的PCV2 cVLPs的分子设计奠定结构信息基础,同时也为多价疫苗的研发和应用奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型 cVLPs 外源表位突变体蛋白组装效率

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治疗自身免疫性疾病的抗细胞因子疫苗

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药学进展 2014年第6期38卷 426-431页

作者：陈超蔡棣田浤高向东中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009

抗细胞因子疫苗是针对疾病相关细胞因子而设计与构建的一类能激发体液免疫应答的主动免疫治疗性疫苗,是用于自身免疫性疾病的一种极具潜力的新型疗法。目前研究与开发的抗细胞因子疫苗主要有2种类型,一种是通过偶联载体或直接修饰为细... 详细信息

抗细胞因子疫苗是针对疾病相关细胞因子而设计与构建的一类能激发体液免疫应答的主动免疫治疗性疫苗,是用于自身免疫性疾病的一种极具潜力的新型疗法。目前研究与开发的抗细胞因子疫苗主要有2种类型,一种是通过偶联载体或直接修饰为细胞因子引入外源表位而构建的蛋白疫苗,另一种则是可表达细胞因子免疫原的核酸疫苗。这两类疫苗在临床前及临床研究中,对各种自身免疫性疾病均显现出治疗活性。简介各类抗细胞因子疫苗及其作用机制,综述用于治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等各种自身免疫性疾病的抗细胞因子疫苗研究进展。

关键词：细胞因子外源表位主动免疫疫苗自身免疫性疾病

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