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辣椒疫霉外泌蛋白PcSEP24的功能分析及肽适体抑菌效果初探

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辣椒疫霉外泌蛋白PcSEP24的功能分析及肽适体抑菌效果初探

作者：施宁雪扬州大学

学位级别：硕士

由卵菌纲的辣椒疫霉（Phytophthora capsici）侵染引起的作物疫病是一类土传毁灭性病害,严重危害数百种农作物的生产,每年给全世界造成巨大的经济损失。一直以来,缺乏安全有效的作物疫病防控手段,主要采用化学农药进行防控。在侵染的过... 详细信息

由卵菌纲的辣椒疫霉（Phytophthora capsici）侵染引起的作物疫病是一类土传毁灭性病害,严重危害数百种农作物的生产,每年给全世界造成巨大的经济损失。一直以来,缺乏安全有效的作物疫病防控手段,主要采用化学农药进行防控。在侵染的过程中,辣椒疫霉等卵菌分泌大量的效应蛋白进入寄主植物体内,调控寄主植物的生理生化过程,破坏其免疫反应,以利于自身的侵染定殖。深入了解辣椒疫霉等卵菌的致病机理和成灾机制,开发新型病害防控技术已成为当前保障农作物安全生产的迫切需求。本课题组前期筛选出5个在侵染寄主植物阶段表达量高度上调的辣椒疫霉外泌蛋白。为了明确这些蛋白的功能,本论文对其中一个蛋白PcSEP24开展了以下研究:（1）预测该蛋白具有信号肽。利用酵母蔗糖酶外泌实验证明了该信号肽具有功能活性;（2）预测该蛋白具有核定位信号,因此在本氏烟叶片中瞬时表达后通过激光共聚焦显微镜观察它的亚细胞定位。结果发现,PcSEP24定位于寄主植物的细胞质和细胞核中;（3）为分析该蛋白对辣椒疫霉侵染的影响,利用农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达该蛋白并接种辣椒疫霉。结果发现,PcSEP24的瞬时表达有助于辣椒疫霉侵染本氏烟;（4）为进一步分析该蛋白对辣椒疫霉致病力的影响,利用CRISPR/Cas9技术敲除辣椒疫霉中的Pcsep24基因。结果显示,基因敲除显著削弱了辣椒疫霉对寄主植物的致病力;（5）为进一步明确该蛋白的作用,构建了转Pcsep24基因本氏烟。通过检测flg22处理后转基因植物中的活性氧迸发、胼胝质沉积;接种辣椒疫霉后植物对不同病原物侵染的反应,发现该蛋白的稳定表达抑制了本氏烟的免疫抗性;（6）为明确该蛋白参与辣椒疫霉侵染致病的作用机制,利用酵母双杂交筛选侵染文库,以及双分子荧光互补、GST pull-down分析,发现该蛋白与辣椒疫霉的一个未知蛋白Pc511533互作;（7）本论文基于前期研究分析了一个靶向葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola）纤维素合酶的肽适体的抑菌活性及其控病效果。平板抑菌实验表明,该肽适体可显著抑制荔枝霜疫霉、寄生疫霉、瓜类疫霉、旋柄植物腐霉、恶疫霉、棕榈疫霉、辣椒疫霉以及樟疫霉的菌丝生长;外源喷施荔枝果实,发现该肽适体可显著抑制荔枝霜疫病的发生。结果表明,靶向卵菌纤维素合酶的肽适体可用作防控卵菌病害的新型生防因子。

关键词：辣椒疫霉外泌蛋白基因敲除转基因植物酵母双杂交肽适体

葡萄溃疡病菌外泌蛋白LtGH61A的致病力及基因表达模式

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中国农业科学 2019年第24期52卷 4518-4526页

作者：彭军波李兴红张玮周莹黄金宝燕继晔北京市农林科学院植物保护环境保护研究所/北方果树病虫害绿色防控北京市重点实验室

【目的】由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌引起的溃疡病是葡萄生产上的重要病害之一,在国内多个葡萄产区发生,严重威胁葡萄的产量及品质。本研究对葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)中一个假定外泌蛋白LtGH61A进行功能分析,为... 详细信息

【目的】由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌引起的溃疡病是葡萄生产上的重要病害之一,在国内多个葡萄产区发生,严重威胁葡萄的产量及品质。本研究对葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)中一个假定外泌蛋白LtGH61A进行功能分析,为进一步解析葡萄溃疡病菌的致病机理及病害防控提供理论依据。【方法】通过SignalP 4.0预测LtGH61A蛋白的信号肽;氨基酸序列同源比对结合基因功能注释,预测LtGH61A蛋白的功能;通过酵母互补试验分析LtGH61A蛋白的外泌特性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析LtGH61A在病原菌营养菌丝及侵染寄主不同阶段的表达量;借助RNA干涉(RNAi)对LtGH61A进行表达抑制;通过葡萄枝干离体接种试验,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌致病力的影响。通过比较菌落直径,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌菌丝生长速率的影响。【结果】信号肽预测表明LtGH61A蛋白N端具有一个长度为18个氨基酸的信号肽;基因功能注释推定LtGH61A的编码产物属于糖苷水解酶61(GH61)家族,能酶解纤维素类物质;互补蔗糖酶外泌缺陷型酵母YTK12结果表明,LtGH61A蛋白的信号肽具有外泌活性,能够引导酵母YTK12蔗糖酶的外泌;与营养菌丝阶段相比,LtGH61A的表达量在病原菌侵染阶段显著升高,并且在接种后48 h高达营养菌丝阶段的19倍;通过RNAi试验及qRT-PCR验证,获得了2个LtGH61A表达量明显降低的阳性转化子,分别命名为RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2;葡萄枝干离体接种试验结果显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子在葡萄枝干形成的病斑长度显著变短,约为野生型CSS-01s的55%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力;菌落直径比较显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子的菌落直径变小,约为野生型85%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的菌丝生长速率。【结论】LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力及生长速率;LtGH61A蛋白能够分泌至胞外;LtGH61A在病原菌侵染阶段的表达量显著升高,推测其通过发挥自身酶活功能,破坏寄主植物组织,从而促进病原菌的侵染。

关键词：葡萄溃疡病菌外泌蛋白致病力表达模式实时荧光定量PCR RNA干涉

可可毛色二孢菌外泌蛋白LtGhp1的功能分析

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可可毛色二孢菌外泌蛋白LtGhp1的功能分析

苹果树腐烂病菌外泌蛋白Vmhp-1互作靶标的鉴定及其干扰免疫功能的研究

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：彭军波 Chethana K W T 李兴红张玮邢启凯燕继晔北京市农林科学院植物保护环境保护研究所

由可可毛色二孢菌侵染引起的葡萄溃疡病在我国葡萄产区广泛发生且造成严重的损失,但关于该病原真菌侵染致病的分子机制并不清楚。本研究室在探究可可毛色二孢菌的致病机理时,克隆到一个假定的外泌蛋白编码基因LtGHP1。预测LtGhp1蛋白N... 详细信息

由可可毛色二孢菌侵染引起的葡萄溃疡病在我国葡萄产区广泛发生且造成严重的损失,但关于该病原真菌侵染致病的分子机制并不清楚。本研究室在探究可可毛色二孢菌的致病机理时,克隆到一个假定的外泌蛋白编码基因LtGHP1。预测LtGhp1蛋白N端具有一个信号肽,酵母互补实验表明该信号肽能够引起酵母蔗糖酶的外泌。LtGHP1基因的超表达、RNAi及病原菌接种实验表明LtGhp1是一个重要的致病因子,不同侵染阶段的RNA积累量分析显示LtGHP1基因在病原菌侵染寄主初期表达量显著升高,并能引起寄主中抗性反应相关基因的上调表达。此外,瞬时表达及活体注射LtGhp1蛋白均能引起烟草细胞的坏死。通过筛选寄主植物的cDNA文库,获得了LtGhp1蛋白在寄主中的互作靶标,关于LtGhp1与互作靶标的调控机理正在分析中。

关键词：可可毛色二孢菌外泌蛋白细胞坏死

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苹果树腐烂病菌外泌蛋白Vmhp-1互作靶标的鉴定及其干扰免疫功能的...

水稻细菌性条斑病菌中受DSF群体感应系统调控的外泌蛋白的功能研究

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：高晨许铭刘召阳高宇琪黄丽丽冯浩旱区作物逆境生物学国家重点实验室西北农林科技大学植物保护学院

苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的枝干病害。解析病菌与寄主的互作机理对病害防控新策略的研发具有重要意义。笔者实验室前期研究发现苹果树腐烂病菌Vmhp-1在侵染过程中上调表达,并通过酵母异源表达后证明Vmhp-1是一种... 详细信息

苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的枝干病害。解析病菌与寄主的互作机理对病害防控新策略的研发具有重要意义。笔者实验室前期研究发现苹果树腐烂病菌Vmhp-1在侵染过程中上调表达,并通过酵母异源表达后证明Vmhp-1是一种外泌蛋白,更重要的是缺失后突变体致病力较野生型显著降低。在此基础上,本研究利用非寄主本氏烟瞬时表达系统发现Vmhp-1会抑制由Bax引起的细胞坏死。亚细胞定位分析发现Vmhp-1定位在烟草细胞膜上,而去掉信号肽Vmhp-1定位在细胞膜和细胞核。Vmhp-1瞬时表达后,水杨酸(SA)通路(NbPR1和NbPR2)、茉莉酸(JA)通路(NbPR4和NbLOX)和乙烯(ETH)通路(ERF1)上的5个maker基因均下调表达,且Vmhp-1可以抑制INF1诱导的活性氧迸发和胼胝质的沉积。同时研究发现,Vmhp-1瞬时表达后降低了烟草对核盘菌(S.sclerotiorum)的抗性水平。进而利用酵母双杂交系统(YH)、双分子荧光(Bifc)和免疫共沉淀技术(Co IP)鉴定到2个与Vmhp-1互作的候选植物靶标。本研究结果为揭示外泌蛋白Vmhp-1调控寄主免疫反应的分子机理奠定了重要基础。

关键词：苹果树腐烂病菌外泌蛋白靶标鉴定植物免疫

来源： cnki会议评论

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水稻细菌性条斑病菌中受DSF群体感应系统调控的外泌蛋白的功能研究

作者：周奕景南京农业大学

学位级别：硕士

小分子DSF (Diffusible Signal Factor)介导的群体感应(Quorum sensing, QS)系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用,但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, X... 详细信息

小分子DSF (Diffusible Signal Factor)介导的群体感应(Quorum sensing, QS)系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用,但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)引起的水稻细菌性条斑病是我国水稻生产上一种重要的细菌病害。本研究以Xoc为对象,研究受DSF调控的外泌蛋白的种类、致病功能及机制,研究结果如下： (一)本实验室赵延存博士的前期研究中鉴定了Xoc中受DSF调控的53个外泌蛋白(赵延存论文,2011)。本研究选取了其中15个感兴趣的目标蛋白用于后续研究。这15个蛋白的功能涉及小分子蛋白介导的群体感应、细胞结构、细胞进程、氧化压力环境的适应、中间代谢、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技术,对这15个蛋白的编码基因进行敲除,获得相应的基因缺失突变株。致病性测定显示其中4个突变株显著削弱了Xoc对寄主水稻的致病性,其对应的蛋白/基因分别是XOC319(Ax21同系物,依赖XA21的水稻免疫激发子)、XOC2128(多聚半乳糖醛酸酶)、XOC3806(蛋白酶)和XOC1601(半胱氨酸蛋白酶)。表型分析表明,这4个基因对Xoc的定殖能力、胞外多糖产量、游动性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化压力等毒力相关表型造成了不同程度的影响。具体结果如下：这4个基因的突变没有影响Xoc的生长速率,但影响了Xoc在水稻中接种发病后的定殖量,同时还均降低了胞外多糖的产量。XOC2128和XOC1601的突变减弱了菌体游动性,XOC319的突变减弱了生物膜的形成,XOC3806和XOC1601的突变减弱了胞外蛋白酶活性,XOC3806和XOC2128的突变使Xoc的抗氧化压力能力有所增强。荧光定量显示这四个基因在Rs105△rpfF的表达水平在一定程度上取决于培养基的营养状况,相关结果和Rs105△rpfF中差异蛋白表达情况不完全一致;同时我们还发现这四个基因对10个已知的致病相关基因存在一定的转录调控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系统关键基因,荧光定量PCR还显示Rs105△rpfF中xpsE的转录表达水平显著下降,说明DSF群体感应系统对Ⅱ型分泌系统的功能存在某种程度的调控作用。此外,Ax21(水稻XA21先天免疫激发子)是Xoo泌出的能在依赖XA21的水稻上激发先天免疫的硫化蛋白,并且Ax21还被认为是Xoo中一种新型群体感应的信号分子;XOC319就是Ax21在Xoc的同系物,本研究说明这两种QS系统的功能很可能存在交叉和联系。本研究是黄单胞菌中第一次对受DSF介导的群体感应调控的外泌蛋白及其功能进行了系统深入分析,相关结果显示了DSF型群体感应系统对11分泌系统毒力因子及AX21介导的群体感应有重要的调控作用,进一步明确了Xoc中DSF型群体感应系统的功能。 (二)病原菌在寄主表面的黏附性是其成功侵染的先决条件,主要在细菌黏附、定殖等侵染早期进程中起重要作用,而这个过程是由被称为黏性因子的蛋白质来完成的。因此我们选择了T5SS泌出的两个非菌毛黏性蛋白XadA、YapH进行研究,对相关基因xadA、yapH进行了缺失敲除,并对它们的致病机制及其与DSF型群体感应系统的关系进行了试验和分析。XadA和YapH是通过V型分泌系统泌出的两个黏性蛋白。我们找到了xadA、yapH的同系物,即XOC、808、XOC、2467,然后构建了缺失突变体△xadA、△yapH。致病相关表型的测定的结果显示这两个黏性蛋白均和Xoc的喷雾接种时的致病性、水稻叶片表面黏附性、胞外多糖合成能力相关,但与非生物表面的黏附性无关。实时定量荧光PCR表明,xadA、yapH的在模拟植物汁液的培养条件下的转录表达水平的变化存在差异,其中yapH能够被这种培养基诱导表达;xadA、 yapH的转录表达受DSF型群体感应通路调控的模式不同,其中yapH受rpfF、clp正向调控,xadA受rpfF、clp负向调控,说明DSF群体感应系统很可能与外泌黏性蛋白功能的发挥密切相关。本研究首次为XadA、YapH在Xoc致病过程中的作用和特点提供了参考。

关键词：水稻细菌性条斑病菌群体感应外泌蛋白功能研究

大豆疫霉胞外多糖及其外泌蛋白处理下大豆的代谢组学研究

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大豆疫霉胞外多糖及其外泌蛋白处理下大豆的代谢组学研究

作者：胡九龙安徽农业大学

学位级别：硕士

在大豆的生产过程中,大豆疫霉(Phytophthora sojae)引致的大豆疫病是影响大豆产量质量最重要的病害之一。早在十几年前,全世界每年因该病而造成的经济损失就已高达十几亿美元;随着大豆疫霉的遗传变异,到了近几年,大豆疫病的危害更加明显... 详细信息

在大豆的生产过程中,大豆疫霉(Phytophthora sojae)引致的大豆疫病是影响大豆产量质量最重要的病害之一。早在十几年前,全世界每年因该病而造成的经济损失就已高达十几亿美元;随着大豆疫霉的遗传变异,到了近几年,大豆疫病的危害更加明显,因此研究大豆疫霉的致病机理显得尤为重要。而在大豆疫霉侵染大豆过程中,它分泌的多糖及蛋白就如同侵染大军的先锋部队,所以通过研究大豆疫霉的胞外粗多糖及外泌蛋白对大豆的生理生化影响可为研究大豆疫霉的致病机理提供实验依据。本论文以大豆疫霉GY8-3菌株为材料,提取胞外粗多糖及外泌蛋白,用它们处理大豆愈伤组织。采用RT-PCR,GC-MS方法,评价粗多糖和外泌蛋白对大豆代谢的影响。结果表明,大豆疫霉胞外粗多糖及其外泌蛋白处理组的NO和活性氧含量较对照组均明显升高,其中胞外粗多糖处理组中的大豆10个抗性相关基因在粗多糖处理6 h后有6个基因明显上调;外泌蛋白处理组中有4个上调。GC-MS鉴定出的代谢物共有58种,其中大豆疫霉胞外粗多糖处理组有20多种代谢物显著变化(P1);如葡萄糖苷和脯氨酸在相对含量(log 2(T/C))升高了 2.51倍,甘露糖2.19倍,丁二酸(琥珀酸)1.22倍;缬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸相对含量分别下降了 2.16倍、1.28倍、0.54倍,丙酸、松醇、肌醇分别下降了 0.91倍、0.75倍、0.54倍。外泌蛋白处理组有30多种代谢物显著变化;如葡萄糖苷相对含量升高了 4.77倍,甘露糖升高2.71倍,这二者都比胞外粗多糖处理组中的升高幅度大,脯氨酸升高了 2.5倍,这与胞外粗多糖处理组升高倍数相近;而缬氨酸、天冬酰胺相对含量并无较大变化。以大豆疫霉胞外粗多糖及其外泌蛋白处理大豆后,不同处理组的大豆体内代谢都发生了变化。二者相同之处是都使大豆系统抗性得到了提高,且都是诱导大豆通过减弱糖酵解途径、增加体内葡萄糖苷、脯氨酸及尸胺的含量等一系列的内部调节来实现对它们刺激的响应;不同之处在于大豆疫霉胞外粗多糖是通过减弱大豆的氮代谢途径、增强大豆的三羧酸循环来影响大豆的生长发育。本实验基于代谢组学的研究,揭示了大豆疫霉GY8-3菌株胞外粗多糖及其外泌蛋白处理下的大豆体内代谢规律,为研究这两类物质在大豆疫霉侵染大豆期间的作用机制提供理论依据,也为研究大豆疫霉的致病机理提供了新的研究思路和方法。同时,也对研究大豆在受到外界刺激时体内的代谢变化规律具有一定的参考意义。

关键词：大豆疫霉大豆胞外粗多糖外泌蛋白 GC-MS 致病机理

信号识别粒子SRP及其受体SR调控稻瘟病菌生长发育及致病力的机制研究

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信号识别粒子SRP及其受体SR调控稻瘟病菌生长发育及致病力的机制...

作者：林涵山东农业大学

学位级别：硕士

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(Rice blast)是水稻上的一种毁灭性真菌病害,每年造成巨大的粮食损失,甚至导致绝收,威胁我国乃至全球的粮食安全。稻瘟病菌侵染水稻依赖两种主要武器发挥功能——附着胞与外泌蛋白。膜蛋白对... 详细信息

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(Rice blast)是水稻上的一种毁灭性真菌病害,每年造成巨大的粮食损失,甚至导致绝收,威胁我国乃至全球的粮食安全。稻瘟病菌侵染水稻依赖两种主要武器发挥功能——附着胞与外泌蛋白。膜蛋白对外界信号的感知是附着胞正常形成的前提,因此,膜蛋白和外泌蛋白对于病菌的成功侵染至关重要。真核生物中,新生的膜蛋白和外泌蛋白靶向转运到内质网的过程,是它们生物合成的关键,主要依靠一类普遍保守的信号识别粒子(Signal recognition particle,SRP)及其受体(SRP receptor,SR)来完成。然而,SRP及SR在稻瘟病菌中的功能仍不清楚。同时,SR的一个亚基SRα在此合成过程中具有不可替代的重要承接、转运作用,但其功能在植物病原真菌中是未知的。本实验旨在研究信号识别粒子SRP及其受体SR调控稻瘟病菌生长发育及致病力的机制,并重点关注其中起承上启下作用的SRα的相关功能,主要得到以下结果:通过同源比对发现,稻瘟病菌中的SRP及SR组分共有5个,分别包括3个SRP(SRP54、SRP68和SRP72)及2个SR(SRα和SRβ),每一个组分的缺失均会影响病菌的产孢及致病能力,但对于病菌的营养生长速率影响不大。同时,SRP与SR的缺失会导致病菌附着胞内膨压显著异常,这可能是突变体致病力下降的原因之一。另外,SRP与SR缺失突变体对于外界胁迫的响应也有不同程度的变化,说明SRP及SR参与调控病菌对外界胁迫的应答。进一步分析发现,起到承上启下作用的SRα亚基与SRP54和SRβ均相互作用,且SRα突变体中膜蛋白与外泌蛋白的定位受到了显著影响,说明SRα具有保守的SR受体功能。在对SRα进行进一步研究时发现,SRα存在被磷酸化修饰的现象,且在侵染阶段磷酸化水平显著上升,暗示SRα磷酸化在病菌侵染过程中发挥重要作用,这也是对于SRα在不同物种中被磷酸化修饰的首次发现。通过免疫共沉淀(CoIP)筛选,发现有多个蛋白激酶及蛋白磷酸酶可能与SRα存在相互作用,并通过酵母双杂交及一对一Co-IP确认了与SRα直接互作的3个蛋白激酶与2个蛋白磷酸酶,暗示这些组分可能与SRα在稻瘟病菌中的磷酸化水平调节直接相关。磷酸化质谱分析发现,SRα存在8个被磷酸化修饰的位点,并且这些位点的持续性激活和持续性失活均无法回补突变体在致病力上的缺陷,说明SRα的磷酸化平衡对于病菌致病力至关重要。最后,通过体外磷酸化确认了3个蛋白激酶可以对SRα直接行使磷酸化作用,为进一步探究SRα磷酸化在稻瘟病菌致病力中的相关功能提供了基础。总体来说,本研究中通过对稻瘟病菌中控制膜蛋白与外泌蛋白合成的SRP及SR组分的功能研究,特别是其中起关键承上启下作用的SRα,揭示了SRP及SR参与调控稻瘟病菌对外界胁迫应答、无性繁殖、功能性附着胞形成及致病力等过程;同时,首次发现了SRα会被磷酸化修饰并确定了具体的磷酸化位点,且明确了该磷酸化修饰与病菌致病力息息相关,为后续开发以该磷酸化位点为靶标的新型稻瘟病防控药剂、实现病害的有效防控提供了理论基础。

关键词：稻瘟病菌信号识别粒子SRP 信号识别粒子受体SR 致病力磷酸化膜蛋白外泌蛋白