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外泌体作为红花miR159a的载体对缺氧损伤H9C2细胞的保护作用

外泌体作为红花miR159a的载体对缺氧损伤H9C2细胞的保护作用

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作者：解曼曼上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:急性心肌梗塞（acute myocardialinfarction,AMI）是指因冠状动脉闭塞,血流中断,使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死。严重威胁患者的生命安全。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是多能干细胞,可... 详细信息

目的:急性心肌梗塞（acute myocardialinfarction,AMI）是指因冠状动脉闭塞,血流中断,使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死。严重威胁患者的生命安全。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是多能干细胞,可修复梗死的心肌细胞,改善心功能。最新研究表明BMSCs对心肌细胞的损伤修复作用主要依靠其旁分泌机制,而外泌体是旁分泌的主要效应因子。课题组前期研究发现,冠心病患者服用红花水煎剂两小时后,外周血中发现植物源microRNA159a（miR159a）的表达。本实验以H9C2细胞缺氧模型为基础,将BMSCs细胞与羟基红花黄素色A（（hydroxysafflor yellow A,HSYA））共培养获取的载药外泌体加入缺氧模型中,观察外泌体介导的植物源microRNA跨物种调控对缺氧H9C2细胞的影响。方法:（1）试剂盒法提取BMSCs细胞上清中的外泌体,采用电镜、粒径分析和表面标志蛋白CD63和TSG101鉴定外泌体;PCR检测外泌体中红花miR159a的表达。（2）将H9C2细胞分为5组:正常组、缺氧组、缺氧+外泌体组、缺氧+HSYA组、缺氧+外泌体HSYA组。在95%的氮气和5%的二氧化碳的环境中培养24h建立细胞缺氧模型。cck8检测H9C2细胞的抗缺氧能力,流式细胞术观察细胞凋亡率,免疫印迹法检测细胞内凋亡蛋白bax、bcl-2及caspas3的表达,酶联免疫吸附实验检测细胞上清中SOD、MDA、LDH的水平。（3）将miR159a模拟物及其阴性对照物转染至H9C2细胞中,观察miR159a对H9C2细胞抗缺氧能力、细胞凋亡率、凋亡蛋白bax、bcl-2及caspas3的表达和细胞上清中SOD、MDA、LDH的水平的影响。结果:（1）电镜、粒径及标志蛋白CD63和TSG101鉴定结果显示,提取物为盘状囊泡结构,直径大小约100nm,CD63和TSG101表达呈阳性。PCR结果显示添加了HSYA干预的BMSCs上清液中外泌体miR159a的表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。（2）与缺氧+外泌体组相比,缺氧+外泌体HSYA组可以显著提高H9C2细胞细胞抗缺氧能力,升高SOD水平,降低MDA、LDH的水平,减少细胞凋亡,降低凋亡蛋白bax和caspas3的表达,增加bcl-2的表达（P＜0.05）。（3）与模型组相比,缺氧+miR159a minic组能显著提高H9C2细胞抗缺氧能力（P＜0.05）,抑制细胞的凋亡（P＜0.05）,升高SOD水平、降低MDA和LDH的水平（P＜0.05）,降低凋亡蛋白bax和caspas3的表达和增加bcl-2的表达（P＜0.05）。结论:（1）.本实验研究证实,exosomes可以作为中药载体携带植物microRNA。（2）.HSYA干预的外泌体可以提高H9C2细胞的抗缺氧能力,增加SOD活性,降低MDA和LDH的水平,并通过增加bcl-2的、降低bax和caspas3的表达抑制细胞凋亡。（3）.HSYA干预的外泌体可以通过递送植物源miR159a,提高细胞抗缺氧、抗氧化、抗凋亡能力,对H9C2细胞缺氧损伤起保护作用。

关键词：外泌体载药羟基红花黄色素A 骨髓间充质干细胞跨物种调控 miR159a 细胞凋亡

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