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基于外切酶和纳米材料信号放大技术的核酸修饰酶活性检测新方法研究

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基于外切酶和纳米材料信号放大技术的核酸修饰酶活性检测新方法研...

作者：马业菲广西师范大学

学位级别：硕士

生物传感技术由于具有分析时间短、成本较低、选择性好、灵敏度高等优点,极大的推动了分析化学在生命科学领域的应用。荧光生物传感技术因其无需分离、操作简单、可进行原位测定、分析成本低等优点而备受关,目前,已广泛用于核酸、蛋白... 详细信息

生物传感技术由于具有分析时间短、成本较低、选择性好、灵敏度高等优点,极大的推动了分析化学在生命科学领域的应用。荧光生物传感技术因其无需分离、操作简单、可进行原位测定、分析成本低等优点而备受关,目前,已广泛用于核酸、蛋白质、生物活性小分子、病毒等的分析检测。纳米材料具有独特的光学和电化学性质,为构建生物传感方法提供了新的思路。近年来,核酸介导的信号放大方法为高灵敏生物检测提供了重要的技术支持,在各类生物分子的检测中得到了广泛应用。基因的修饰过程与癌症的发生发展有着密切关系,而基因修饰受到各种核酸修饰酶的协同调控。因此,建立核酸修饰酶活性检测的新方法新技术,在癌症等重大疾病的早期诊断与治疗,以及癌症发病机理研究中具有重要意义。本论文将纳米材料和核酸信号放大技术应用于荧光生物传感构建,发展了三种荧光生物检测体系,分别用于Dam甲基转移酶、碱基切除修复酶等酶活性测定。具体研究内容如下：1.发展了一种基于氧化石墨烯和T7核酸外切酶辅助循环信号放大的荧光方法用于DNA甲基转移酶(MTase)的活性检测和抑制剂筛选。研究中使用Dam甲基转移酶作为模型分析物。在Dam甲基转移酶存在时,发夹结构DNA底物探针被甲基化,然后被DpnI核酸限制性内切酶识别并进行切割,释放出单链DNA片段。随后释放的单链DNA与FAM荧光团标记的信号探针(DP探针)杂交。在形成的杂交体中,DP探针的5’端为钝末端,而被释放的单链DNA5’端多出4个碱基。此时,T7核酸外切酶能够对杂交体中DP探针进行降解并释放出单链DNA。释放的单链DNA引发下一轮的杂交-降解循环。最终大量的FAM荧光团从DP探针5’端释放。由于较低的亲和力,释放的FAM不能被吸附到氧化石墨烯表面,荧光信号被保留。相反,在没有Dam甲基转移酶存在时,DP探针可被氧化石墨烯吸附,导致荧光猝灭。将T7核酸外切酶高效的降解能力与氧化石墨烯超强的荧光猝灭效率相结合,从而获得较大的信号背景比,提高了Dam甲基转移酶活性测定的灵敏度。并且该方法不需要设计特定的酶识别位点,也不需要进行荧光团/淬灭团的双标记,使得实验设计简单,成本低廉。此外,该方法也适用于Dam甲基转移酶抑制剂的测定。2.构建了一种基于二硫化钨纳米片及核酸外切酶Ⅲ共辅助信号增强策略的DNA糖基化酶荧光偏振检测方法。在本工作中,我们以尿吡啶DNA糖基化酶(UDG)和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)为研究模型。底物探针HP颈部含受损的碱基,在DNA糖基化酶存在情况下会切除受损的碱基,此时HP熔链温度降低,并且打开。打开后的HP会与FAM标记的单链DNA(DP)杂交,在杂交体中,DP的3’端是凹末端,Exo Ⅲ会对杂交体中DP进行消化,通过DP不断的杂交与释放过程,大量的FAM被释放,释放的FAM不会吸附到WS2纳米片表面,荧光偏振信号值很小。没有DNA糖基化酶活时,DP与HP不会杂交,因此ExoⅢ不会降解DP。单链DP能够吸附到WS2纳米片表面,质量变大,偏振增强。结合WS2纳米片和ExoⅢ共同辅助信号放大作用,可实现对DNA糖基化酶的高灵敏测定。此外,该方法也实现了对细胞粗提取物中UDG活性测定。并实现对UDG活性的抑制试验。最后,该方法设计简单,易于操作,选择性好,有望用于DNA糖基化酶相关机制研究和疾病诊断中。3.利用SG I作为荧光信号分子,基于核酸外切酶I (Exonuclease I, Exo I)的信号放大构建了一种简单、经济、高灵敏的荧光方法用于UDG活性检测。本工作中,以茎部区域含有四个尿嘧啶碱基的发夹探针(HP)作为UDG的底物。在没有UDG存在时,SG I染料可以与HP结合,荧光大大增强。UDG作用后,尿嘧啶碱基将被从核酸骨架上移除,形成脱碱基位点,从而降低发夹底物探针的解链温度,使得发夹底物探针会在我们实验设定的温度下分开,荧光信号降低。当使用Exo I切割ssDNA,会进一步降低荧光强度。从而实现对UDG的高灵敏检测,其检测下限为0.0070 U/mL。此外,该方法在复杂的生物样品具有检测的可能性,并且可用于研究5-氟尿嘧啶对UDG活性的抑制作用。

关键词：荧光传感外切酶纳米材料核酸信号放大 DNA甲基转移酶碱基切除修复酶

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基因转录终止的分子机制获揭示 001

基因转录终止的分子机制获揭示

金属离子对纤维素酶内切酶和外切酶活性的影响

中国科学报

作者：江庆龄

本报讯（见习记者江庆龄）中国科学院分子植物科学卓越创新中心/中国科学院合成生物学重点实验室研究员张余课题组成功解析了酵母细胞mRNA（信使核糖核酸）转录终止状态的复合物结构，揭示了核酸外切酶介导mRNA转录终止的分子机制，对... 详细信息

本报讯（见习记者江庆龄）中国科学院分子植物科学卓越创新中心/中国科学院合成生物学重点实验室研究员张余课题组成功解析了酵母细胞mRNA（信使核糖核酸）转录终止状态的复合物结构，揭示了核酸外切酶介导mRNA转录终止的分子机制，对进一步理解基因转录的工作机制具有重要意义

关键词：转录终止聚合酶外切酶分子机制

来源： cnki报纸评论

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纤维素科学与技术 2011年第4期19卷 6-13页

作者：张洪鑫陈小泉蒋玲玲华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室广东广州510640

金属离子可以影响纤维素内、外切酶的活性,且不同金属离子对其活性影响程度也不同。据此,本实验选取三种纤维素酶进行单因素实验,对其内、外切酶活性进行研究。实验结果表明,当金属离子的质量浓度为:K+0.9 mg/mL,Ca2+0.3 mg/mL,Zn2+1.2 ... 详细信息

金属离子可以影响纤维素内、外切酶的活性,且不同金属离子对其活性影响程度也不同。据此,本实验选取三种纤维素酶进行单因素实验,对其内、外切酶活性进行研究。实验结果表明,当金属离子的质量浓度为:K+0.9 mg/mL,Ca2+0.3 mg/mL,Zn2+1.2 mg/mL,Cu2+1.2 mg/mL,能较好地提高纤维素内切酶活;而Mg2+﹑Ca2+﹑Ba2+﹑Cu2+﹑Zn2对纤维素外切酶活都有抑制作用;Al3+对纤维素内、外切酶活都有抑制作用;不同价态阴离子对纤维素内、外切酶活影响不大。

关键词：纤维素酶内切酶外切酶酶活:金属离子

基于外切酶Ⅲ辅助靶标循环及DNAzyme释放策略的高灵敏DNA传感平台构筑研究

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基于外切酶Ⅲ辅助靶标循环及DNAzyme释放策略的高灵敏DNA传感平台...

以环状RNA为靶点的中药抗肿瘤治疗研究进展

中国化学会第29届学术年会

作者：程传斌刘涛王丽刘树峰化学与分子工程学院青岛科技大学

为满足重大疾病早期诊断及临床干预需求,亟需发展简单、快速、高（超）灵敏DNA传感检测技术。为此,我们提出了一种简单、等温外切酶III辅助靶标循环及DNAzyme释放策略（Fig.1）。设计茎环结构DNA,靶标DNA存在时,引发外切酶III切割茎环D... 详细信息

为满足重大疾病早期诊断及临床干预需求,亟需发展简单、快速、高（超）灵敏DNA传感检测技术。为此,我们提出了一种简单、等温外切酶III辅助靶标循环及DNAzyme释放策略（Fig.1）。设计茎环结构DNA,靶标DNA存在时,引发外切酶III切割茎环DNA,释放出靶标DNA,循环作用。同时释放出DNAzyme功能单元,铅离子作用下,切割分子信标DNA,荧光信号增强,实现靶标DNA的检测。在此基础上,我们通过巧妙设计探针DNA,发展了一种外切酶III辅助自催化靶标循环策略,靶标循环同时,释放出靶标类似物,充当二次靶标,间接扩增了靶标数量,进一步提高靶标DNA的检测灵敏度,针对靶标的检测限可达20fM。

关键词： DNA传感器 DNAzyme 外切酶靶标循环

来源： cnki会议评论

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中国中西医结合杂志 2022年第12期42卷 1520-1524页

作者：刘洁林久茂福建中医药大学中西医结合研究院福州350122 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室福州350122 中西医结合基础福建省高等学校重点实验室福州350122

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一组分子呈封闭环状结构,且不具有编码功能的转录本。由于其共价闭合的环结构,没有3’和5’末端,因此不易被外切酶降解[1]。与线性RNA比较,它更为保守和稳定,广泛存在于真核细胞的细胞质中。1976年,Sang... 详细信息

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一组分子呈封闭环状结构,且不具有编码功能的转录本。由于其共价闭合的环结构,没有3’和5’末端,因此不易被外切酶降解[1]。与线性RNA比较,它更为保守和稳定,广泛存在于真核细胞的细胞质中。1976年,Sanger HL等[2]首次在植物病毒中发现了单链共价闭合circRNA分子。

关键词：植物病毒环状结构编码功能治疗研究进展中药抗肿瘤外切酶转录本

用外切酶Ⅲ降解和修复合成测定DNA序列的快速方法

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医学分子生物学杂志 1983年第3期 145-145页

作者：刘敬忠

由于快速简便DNA测序方法的发展,使最近对基因结构和功能的了解有了许多重大进展。Sanger等的双脱氧末端终止法便是一种既简便快速又准确的方法。但此法需要单链DNA模板及特异性引物。已经有一些报道简化了模板和引物的提取步骤。例如,... 详细信息

由于快速简便DNA测序方法的发展,使最近对基因结构和功能的了解有了许多重大进展。Sanger等的双脱氧末端终止法便是一种既简便快速又准确的方法。但此法需要单链DNA模板及特异性引物。已经有一些报道简化了模板和引物的提取步骤。例如,把待测序的DNA片段克隆进双链复制型嗜菌体M13衍生物中,得到单链DNA模板,再与

关键词：单链测序引物外切酶质粒基因载体双脱氧 DNA 末端终止法序列

酶切保护聚合酶链反应检测多环芳烃受体与特异性DNA的结合

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中华预防医学杂志 2005年第2期39卷 103-106页

作者：孙晞李芳孙纳王小利陈启政严红徐顺清华中科技大学同济医学院环境医学研究所

目的　建立一种改进的核酸外切酶保护聚合酶链反应 (PCR)检测DNA 蛋白质结合物。方法　将 1pmol/L至 10nmol/L二英溶液 (TCDD)与 100μl含不同浓度多环芳烃受体的SD大鼠肝细胞溶质温育,再与 1fmol至 100nmol含二英反应元件的寡核苷... 详细信息

目的　建立一种改进的核酸外切酶保护聚合酶链反应 (PCR)检测DNA 蛋白质结合物。方法　将 1pmol/L至 10nmol/L二英溶液 (TCDD)与 100μl含不同浓度多环芳烃受体的SD大鼠肝细胞溶质温育,再与 1fmol至 100nmol含二英反应元件的寡核苷酸探针作用形成复合物,用核酸外切酶Ⅲ和S1核酸酶进行消化后进行PCR,通过琼脂糖电泳检测PCR产物。同时设阴性对照(二甲基甲砜,DMSO)和空白对照。结果　在实验组用琼脂糖电泳可以检测到期望大小片段 (285bp)的DNA, 而对照组均为阴性。在一定范围类TCDD浓度与结合DNA之间存在剂量效应关系。检测到的最小受体量为 2. 5fmol,最小DNA量为 2fmol。结论　核酸外切酶保护PCR无放射性污染,灵敏度和特异性高,简便易行,可作为DNA 蛋白质结合物的定性检测方法。

关键词：受体 DNA 琼脂糖电泳特异性结合物聚合酶链反应检测对照组外切酶核酸酶切

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废新闻纸酶法脱墨过程中纤维形态的变化

中国造纸学报 2000年第B12期15卷 23-28页

作者：秦梦华高培基赵越傅英娟邵志勇王权山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 山东轻工业学院济南250100

在酶法脱墨条件下 ,单纯的内切酶作用不会导致纤维平均长度和粗度的下降 ,这是纤维改性的基础 ,而内切酶和外切酶的协同作用使纤维的平均长度和粗度下降 ,是纸浆物理强度下降的原因之一。废新闻纸中的纤维与纤维素酶的作用可按下列步骤... 详细信息

在酶法脱墨条件下 ,单纯的内切酶作用不会导致纤维平均长度和粗度的下降 ,这是纤维改性的基础 ,而内切酶和外切酶的协同作用使纤维的平均长度和粗度下降 ,是纸浆物理强度下降的原因之一。废新闻纸中的纤维与纤维素酶的作用可按下列步骤进行 :纤维表面的细小物质或细纤维首先被降解 ,从而使纸浆的滤水性能得到改善 ;纤维表面进一步发生剥皮作用 ,从而使纤维表面更为光滑 ;内切酶和外切酶的协同作用使纤维的横断面遭到蚕食。

关键词：酶法脱墨废新闻纸纸浆内切酶纤维形态滤水性能外切酶粗度发生下降

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拟康氏木霉S—38中纤维素酶的动力学研究

纤维素科学与技术 1997年第1期5卷 16-20页

作者：阎伯旭高培基山东大学微生物研究所济南250100

采用动力学的方法研究了等温条件下PH值变化对拟康氏木霉中两个外切酶（CBHⅠ，CBHⅠ）和一个内切酶（EGⅠ）动力学参数的影响。结果表明，EGⅠ游离酶的pKe1及pKe2分别为4．4和5．7，EGⅠ酶—底物复合物的pKes1及pKes2分别为3．6和5．5... 详细信息

采用动力学的方法研究了等温条件下PH值变化对拟康氏木霉中两个外切酶（CBHⅠ，CBHⅠ）和一个内切酶（EGⅠ）动力学参数的影响。结果表明，EGⅠ游离酶的pKe1及pKe2分别为4．4和5．7，EGⅠ酶—底物复合物的pKes1及pKes2分别为3．6和5．5；外切酶CBHⅠ的pKe1及pKe2分别为3．6和6．3，pKes1及pKes2分别为3．4和6．0；外切酶CBHⅡ的pKe1及pKe2分别为3．6和6．2，pKes1及pKes2分别为3．4和5．9。这些结果说明纤维素酶中存在两个羧基或一个羧基和一个咪唑基参与酶的催化反应，这种机制和溶菌醇是相似的。

关键词：纤维素酶动力学外切酶内切酶拟康氏木霉