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暹罗芽胞杆菌GUWM35生防机制初探及复合菌剂研制

暹罗芽胞杆菌GUWM35生防机制初探及复合菌剂研制

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作者：周志成贵州大学

学位级别：硕士

芽胞杆菌（Bacillus）具有生防机制多样化、不易产生抗药性、生产成本低、对人畜安全等优点,已成为农业病害生物防治重要的微生物种类。此外,因其还具备繁殖速度快、发酵工艺简单、货架期长等优势,是生防制剂研发中使用最广泛的菌种。... 详细信息

芽胞杆菌（Bacillus）具有生防机制多样化、不易产生抗药性、生产成本低、对人畜安全等优点,已成为农业病害生物防治重要的微生物种类。此外,因其还具备繁殖速度快、发酵工艺简单、货架期长等优势,是生防制剂研发中使用最广泛的菌种。本研究采用实验室前期从乌蒙大草原野生杜鹃根际土壤中分离获得的1株具有良好抑菌效果的生防芽胞杆菌GUWM35作为研究材料。GUWM35现保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC NO:24078）,已申请授权发明专利（CN202210562626.6）。本研究通过盆栽试验测定该菌对烟草黑胫病的室内防病效果;基于形态学、生理生化特征及分子系统学鉴定方法,明确分类学地位;通过全基因组测序分析,挖掘抗菌、促生等相关基因;采用平板对峙法测定发酵液粗提物和挥发性物质（VOCs）对不同植物病原真菌菌丝生长速率的抑制效果;采用饲喂法测定杀蚜虫活性;超高效液相色谱法（UHPLC）和气相色谱-质谱（GC-MS）检测发酵液粗提物和VOCs中的抗菌和促生活性物质种类,初步明确该菌株的抑菌机制;通过指示培养基评价产IAA、产ACC脱氨酶、溶磷以及产铁载体能力,盆栽试验检测菌株在烟草根际的定殖水平,初步解析该菌株的促生和定殖机制;以GUWM35、*** GUMT319和*** GUMT323为主要活性成分,采用单因素法和响应曲面法优化3株菌株及复合菌剂的发酵培养条件、制剂填料、造粒条件和大田应用,初步分析了复合菌剂对烟草黑胫病田间防治效果。以期为西南地区喀斯特高原适应性菌株的生防机制和制剂研究提供理论基础。主要研究结果如下:***35鉴定及全基因组测序分析。（1）GUWM35鉴定:通过形态学、生理生化特征、16S r DNA、gyr A和gyr B多基因序列以及核心基因构建系统发育进化树,将GUWM35鉴定为暹罗芽胞杆菌（***）。（2）全基因组分析:GUWM35基因组为3,940,043 bp,平均GC含量为46.6%,不含质粒,具有4,052个蛋白质编码基因;该菌具有13个次级代谢产物生物合成基因簇,其中可能编码一种新的羊毛硫脂肽类（lantipeptide）物质;该菌具有71个以上定殖相关基因,包括趋化和运动、生物膜形成、铁载体生物合成和群体感应等;以及54个以上促生相关基因,包括磷利用、生长素合成、氮固定、亚精胺和多胺生物合成相关基因等。（3）比较基因组学分析:相较于*** SCSIO 05746和*** KCTC 13613,*** GUWM35具有更多的脂肽类物质和聚酮类化合物的生物合成相关基因。***35生防机制初步分析。（1）抑菌机制:GUWM35对15种植物病原真菌具有良好的抑制效果,可对病原真菌的细胞膜和核膜造成不可逆的损伤。基于UHPLC和GC-MS对GUWM35发酵液粗提物和VOCs进行分析,分别检测出1,034和272种化合物,其中有57种小分子化合物和30种挥发性化合物被报道具有抑制真菌、细菌、线虫、蚜虫和病毒活性。室内盆栽表明GUWM35对烟草黑胫病具有良好的防效,防效达73.0%,和生产上主用药剂58%甲霜灵·锰锌WP的防效相当;（2）促生和定殖机制:菌株GUWM35可显著提高烟草种子萌发率及烟草幼苗的根长、茎长和根鲜重;在72小时内能产生39.4 mg/m L的IAA,ACC脱氨酶活性为0.2 U/mg,能利用有机磷和无机磷产生83.6 mg/L和45.3 mg/L的可溶性磷;采用菌悬液（1×10～8 CFU/m L）灌根处理烟草15 d后,GUWM35在烟草根部定殖量能达到7.6×10～7 CFU/g。3.复合微生物菌剂研制。（1）发酵条件筛选及优化:GUMT319、GUMT323和GUWM35最优混合比例为1:1:1;培养基配方最优配比豆粕8.0-9.0 g/L、花生粕11.5-13.0 g/L、麦麸12.0-15.0 g/L、Mg SO·7HO 5.0 g/L、KHPO 10.0 g/L、Na HPO 10.0g/L和Zn Cl 6.0 mg/L;摇瓶最优培养条件为转速220-230 rpm,温度为37.0-38.0℃,初始p H为7,接种量为6%和装瓶量为150 m L（250 m L三角瓶）;最适5 L发酵罐培养条件为温度为37℃、通气量为2.5 m3/h、装量为3.0 L、接种量为0.8%;（2）造粒条件筛选:复合菌剂配方:1%复合芽胞杆菌发酵液(活菌数为1.7×10 CFU/m L)、6%十二烷基硫酸钠（SDS）、5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、3%可溶性淀粉、4%聚乙二醇6000（PEG-6000）和82%高岭土;造粒条件:1.0%的母粒,颗粒直径1.0 cm,干燥

关键词：暹罗芽胞杆菌全基因组学分析生防机制抑菌机制非靶向代谢组学复合芽胞杆菌菌剂

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