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上海交通大学学报（医学版） 2022年第8期42卷 1034-1044页

作者：宗春燕何杰张哲贾仁兵沈键锋上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科上海市眼眶病眼肿瘤重点实验室上海200011

目的·研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B,APOBEC3B)在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)中的生物学功能以及对药物治疗敏感性的影响。方法·应用免疫组织化学染色和West... 详细信息

目的·研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B,APOBEC3B)在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)中的生物学功能以及对药物治疗敏感性的影响。方法·应用免疫组织化学染色和Western blotting,分别检测眼部黑色素瘤[UM和结膜黑色素瘤(conjunctival melanoma,CM)]组织和细胞中APOBEC3B蛋白的表达水平。通过检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,分析UM中APOBEC3B表达水平与预后的关联。使用CRISPR-Cas9质粒APOBEC3B-sgRNA敲除UM细胞系OMM2.3中APOBEC3B基因,构建APOBEC3B敲除的OMM2.3稳转细胞系sgAPOBEC3B以及对照细胞系Vector;并通过克隆形成实验,探索APOBEC3B敲除对OMM2.3细胞增殖的影响。同时,通过APOBEC3B-shRNA和空载质粒建立APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞shAPOBEC3B和对照细胞shCtrl,对其进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),检测差异基因,并通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)揭示APOBEC3B调控的下游通路。通过免疫荧光染色鉴定下游通路的关键蛋白。通过应用通路靶向药物处理,检测APOBEC3B对UM药物治疗敏感性的影响。结果·免疫组织化学染色结果表明眼部黑色素瘤(UM和CM)组织相较于良性色素痣组织APOBEC3B表达更高。Western blotting也表明包括OMM2.3细胞在内的大多数眼部黑色素瘤细胞相较于正常对照细胞(视网膜色素上皮细胞)APOBEC3B蛋白表达水平更高。并且TCGA数据库分析表明,APOBEC3B高表达的UM患者总生存期(P=0.032)和无病生存期(P=0.000)更短。然而APOBEC3B敲除并不影响OMM2.3细胞克隆形成的能力,APOBEC3B敲低也没有造成细胞周期的显著改变。shAPOBEC3B和shCtrl细胞系的RNA-seq差异基因富集分析结果显示,APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞的复制应激相关通路,并且热图分析也显示APOBEC3B敲低后DNA复制应激相关通路基因表达发生改变。免疫荧光染色结果显示,APOBEC3B敲低后复制应激通路关键靶标磷酸化的复制蛋白A 32 kDa亚基(replication protein A 32 kDa subunit,RPA32)水平降低。在对APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞和对照细胞的药物敏感性实验中,发现相较于shAPOBEC3B细胞,shCtrl细胞对细胞周期检测点激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)抑制剂的敏感性更高。结论·APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞复制应激相关通路,且APOBEC3B表达的OMM2.3细胞对CHK1抑制剂的处理更为敏感。

关键词：载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(APOBEC3B) 葡萄膜黑色素瘤复制应激细胞周期检测点激酶1(CHK1)抑制剂

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靶向胶质母细胞瘤中的复制应激

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世界肿瘤研究 2022年第2期12卷 42-51页

作者：陈佳敏吴亮中国药科大学江苏南京

胶质母细胞瘤是成人常见的原发性脑肿瘤,病程短,预后差,具有极强的治疗抗性,目前临床治疗仍然以手术切除辅以放化疗为主。近期,新兴的电场疗法被加入到胶质母细胞瘤的辅助疗法中,其是否有效尚存在争议。在过去50年里,胶质母细胞瘤的药... 详细信息

胶质母细胞瘤是成人常见的原发性脑肿瘤,病程短,预后差,具有极强的治疗抗性,目前临床治疗仍然以手术切除辅以放化疗为主。近期,新兴的电场疗法被加入到胶质母细胞瘤的辅助疗法中,其是否有效尚存在争议。在过去50年里,胶质母细胞瘤的药物研发停滞不前,临床急需有效的药物改善患者预后。早期研究表明,由于DDR通路的异常上调,GBM (Glioblastoma)是一种先天耐受放化疗的肿瘤。基于现有治疗GBM的方法均会造成DNA损伤的特点,抑制DDR通路激活,加剧复制应激可能是改善GBM患者预后的有效策略。因此,我们对目前GBM的治疗概况以及靶向GBM中的DDR通路,增强现有DNA损伤疗法的相关研究进展进行了综述。

关键词：胶质母细胞瘤替莫唑胺复制应激 DNA损伤反应合成致死

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ATR抑制剂抗肿瘤治疗的研究新进展

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中国肿瘤临床 2023年第15期50卷 791-796页

作者：刘竹君(综述) 刘东颖(审校) 天津医科大学肿瘤医院肺部肿瘤内科国家恶性肿瘤临床医学研究中心天津市"肿瘤防治"重点实验室天津市恶性肿瘤临床医学研究中心天津市肺癌诊治中心天津市300060 天津医科大学肿瘤医院疼痛治疗科国家恶性肿瘤临床医学研究中心天津市"肿瘤防治"重点实验室天津市恶性肿瘤临床医学研究中心天津市肺癌诊治中心天津市300060

DNA损伤应答(DNAdamageresponse,DDR)机制包括检测DNA损伤,阻滞细胞周期和启动DNA修复。共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and Rad3-related,ATR)是DDR核心的关键激酶,负责感知复制应激(replica-tion stress,RS)并将其信号传导至S和G2/M检查点以启动DNA修复。在肿瘤细胞中G1检查点缺失和癌基因的激活,导致癌症细胞更多进入RS增加的S期。因此,肿瘤细胞更加依赖S和G2/M检查点,使其成为一个有吸引力的靶点。ATR抑制剂是目前抗肿瘤药物开发的热点,部分ATR抑制剂目前已经进入临床试验阶段。本综述旨在总结支持ATR抑制剂作为单药以及与化疗、放疗和新型靶向药物(如PARP抑制剂)联合使用的临床试验数据,并讨论目前ATR抑制剂开发和生物标志物探索中面临的挑战。

关键词： ATR DNA损伤应答 ATR抑制剂复制应激

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RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461激活血管平滑肌细胞中ATM/ATR通路的机制研究

RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461激活血管平滑肌细胞中ATM/ATR通路的机...

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作者：刘腾飞山东大学

学位级别：硕士

研究背景细胞中核仁是核糖体DNA（ribosomal DNA,rDNA）转录和核糖体生物合成的场所。干扰RNA聚合酶I（RNA polymerase I,PolI）介导的rDNA转录可触发一种独特的细胞应激反应,称为核仁应激（Nucleolar stress）。CX-5461是一种新型的RN... 详细信息

研究背景细胞中核仁是核糖体DNA（ribosomal DNA,rDNA）转录和核糖体生物合成的场所。干扰RNA聚合酶I（RNA polymerase I,PolI）介导的rDNA转录可触发一种独特的细胞应激反应,称为核仁应激（Nucleolar stress）。CX-5461是一种新型的RNA聚合酶I的特异性抑制剂,具有高选择性,对Pol Ⅰ有明显的抑制作用。研究证实,CX-5461能够抑制肿瘤细胞增殖,并对白血病和实体肿瘤有很好的治疗效果,目前已经作为治疗某些血液肿瘤的新药进入Ⅱ期临床试验。我们课题组前期发现在血管平滑肌细胞中应用CX-5461诱导核仁应激能够引起G2/M细胞周期阻滞,并引起某些细胞衰老标志物的表达上调,并且CX-5461能够显著抑制动脉损伤造成的新生内膜增生,也能够减轻移植血管新生内膜的形成。体外实验中我们也发现在血管平滑肌细胞中加入CX-5461后,出现明显的核仁蛋白NPM转位,并且引起p53磷酸化水平升高,但是未检测到p53蛋白的积累。我们证实CX-5461能激活原代血管平滑肌细胞中ATM/ATR通路,进而促进p53磷酸化,并且ATR-p53通路是介导CX-5461在血管平滑肌细胞中增殖抑制作用的重要通路。研究目的CX-5461在血管平滑肌细胞中如何激活ATM/ATR通路引起下游p53磷酸化的机制目前尚不清楚。因此,我们进一步深入探究在血管平滑肌细胞中CX-5461 激活 ATM/ATR 通路的药理学作用和可能的机制。具体的研究内容包括:（1）验证CX-5461抑制血管平滑肌细胞增殖的浓度依赖性,并检测CX-5461在血管平滑肌细胞中激活ATM/ATR-p53通路是否具有类似的浓度依赖性关系;（2）探究CX-5461激活ATM/ATR-p53通路是否伴随有DNA损伤反应及DNA链断裂的发生;（3）鉴定CX-5461激活血管平滑肌细胞ATM/ATR通路是否与增加G-四链体结构及转录复制冲突相关。研究方法***-5461对细胞增殖和ATM/ATR通路的影响:在血管平滑肌细胞中,给予不同浓度的CX-5461刺激24h,采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞增殖情况;免疫荧光检测核仁应激反应;Western Blot检测p53蛋白磷酸化水平。2.用CX-5461处理细胞24h后,免疫荧光检测p-ATM、p-ATR、γH2AX蛋白水平;彗星实验（Comet assay）检测是否发生DNA链断裂;免疫荧光检测是否存在DNA的损伤修复:XPA（核苷酸切除修复）、MSH2（错配修复）、DNA PKcs（非同源末端链接）、Rad51（同源重组）。***/ATR的上游通路机制研究。免疫荧光、蛋白质免疫沉淀检测复制应激（Replication stress）:复制蛋白A（RPA）、PCNA的单泛素化水平;免疫荧光检测ATM/ATR激活过程中是否涉及G-四链体和R-loop的形成。4.慢病毒载体介导的TIF-1A基因沉默:在血管平滑肌细胞中沉默TIF-1A基因后,免疫荧光检测γH2AX和Rad51蛋白的激活情况（TIF-1A蛋白是rDNA转录起始复合物的关键组分）。研究结果1.在处于增殖状态的血管平滑肌细胞中,不同浓度的CX-5461（0.5μM、1μM、5μM、10μM）能够浓度依赖性地抑制细胞增殖,并且CX-5461所诱导核仁应激反应及p53磷酸化水平增加具有与其类似的浓度依赖性。***-5461刺激处于增殖状态的细胞以后,免疫荧光结果显示细胞内p-ATM、p-ATR、γH2AX水平增加,彗星试验结果显示细胞内无明显的DNA链断裂发生;另外,免疫荧光结果显示,细胞内核苷酸切除修复、错配修复和非同源末端连接修复途径均未激活,但同源重组修复途径被激活。***-5461刺激处于增殖状态的细胞以后,免疫荧光结果显示细胞内RPA foci增多,蛋白质免疫沉淀结果显示PCNA单泛素化水平升高;此外,免疫荧光结果显示,细胞内G-四链体及R-loop结构无明显增加。4.通过慢病毒载体将细胞内TIF-1A基因沉默,免疫荧光结果显示细胞内出现γH2AX和Rad51蛋白的激活。结论:在血管平滑肌细胞中,CX-5461能够浓度依赖性地抑制细胞增殖、诱导核仁应激反应,并且激活ATM/ATR通路。CX-5461激活ATM/ATR通路过程中不伴随G-四链体及R-loop的增加,没有导致明显的DNA链断裂,而是可能与增加DNA复制应激有关。

关键词： CX-5461 RNA聚合酶Ⅰ DNA损伤反应复制应激转录-复制冲突

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MUS81-EME1维持基因稳定性作用研究进展

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山东医药 2020年第8期60卷 98-101页

作者：贺鸿桂徐祖敏广东医科大学附属医院广东湛江524000

MUS81-EME1是结构特异性核酸内切酶,在维持基因组的稳定性中起重要作用。MUS81-EME1能促进同源重组修复、链间交联修复,也能促进染色体普通型脆弱位点的表达,还能处理复制过程中停滞的复制叉,重新启动复制。MUS81-EME1可与其他结构特异... 详细信息

MUS81-EME1是结构特异性核酸内切酶,在维持基因组的稳定性中起重要作用。MUS81-EME1能促进同源重组修复、链间交联修复,也能促进染色体普通型脆弱位点的表达,还能处理复制过程中停滞的复制叉,重新启动复制。MUS81-EME1可与其他结构特异性核酸内切酶SLX1-SLX1、XPF-ERCC1形成合适的多聚体结构,能增强其作为分解酶的活力。MUS81-EME1的活性受细胞周期蛋白、复制检查点的调控。最新一些研究表明,MUS81-EME1能处理复制应激下的反向复制叉,从而促进肿瘤细胞的DNA复制,起到潜在致癌作用。

关键词：结构特异性核酸内切酶 MUS81-EME1 基因组稳定性同源重组修复链间交联修复普通型脆弱位点复制应激反向复制叉

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