检索结果-南通市图书馆

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

调控质粒拷贝数优化生物催化效率的研究进展

食品与发酵工业 2024年第6期50卷 282-289页

作者：李业严豪刘梦婷白仲虎江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程研究院广东深圳518000

质粒作为外源基因异源表达的普遍载体,在合成生物学中广泛应用。不同质粒载体在细胞工厂中的拷贝数不尽相同,合理利用拷贝数不同的质粒可以优化目标基因表达水平,提高生物催化效率。针对天然质粒复制子系统的局限,近年来研究者们依据质... 详细信息

质粒作为外源基因异源表达的普遍载体,在合成生物学中广泛应用。不同质粒载体在细胞工厂中的拷贝数不尽相同,合理利用拷贝数不同的质粒可以优化目标基因表达水平,提高生物催化效率。针对天然质粒复制子系统的局限,近年来研究者们依据质粒复制机制,开发出了许多性能更优异的新质粒系统,显著提高了生物催化效率。该文结合质粒拷贝数在多种微生物细胞工厂中的应用进行综述,以期为合成生物学领域的相关研究提供参考和借鉴。

关键词：异源表达质粒复制子拷贝数合成生物学

规模化畜禽养殖粪便中接合型耐药质粒污染及耐药基因赋存特征

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

环境科学 2024年

作者：李莹申磊高浩泽郭雅杰王旭明赵国柱仇天雷北京林业大学生物科学与技术学院北京市农林科学院生物技术研究所廊坊师范学院生命科学学院

近年来，细菌病原体中抗生素耐药性的出现和传播对公众健康构成严重的威胁。为了解规模化养殖畜禽粪便中质粒介导的可移动抗生素耐药基因（ARGs）的赋存情况和转移特征，对北京、河北和宁夏等地区的蛋鸡、肉鸡和生猪规模化养殖场粪便进... 详细信息

近年来，细菌病原体中抗生素耐药性的出现和传播对公众健康构成严重的威胁。为了解规模化养殖畜禽粪便中质粒介导的可移动抗生素耐药基因（ARGs）的赋存情况和转移特征，对北京、河北和宁夏等地区的蛋鸡、肉鸡和生猪规模化养殖场粪便进行耐药接合型质粒（CARP）的捕获与分析。采用滤膜接合法对养殖场畜禽粪便中的CARP进行捕获并计算转移频率和流行率。通过接合子基因组二代测序获得质粒携带ARGs信息，比对PlasimidFinder 数据库鉴定耐药质粒的复制子类型。利用药敏纸片扩散法（Kirby-Bauer法）对接合子进行耐药表型测定。结果表明，35个规模化养殖场捕获了125个CARP，共携带13类65种ARGs，最常见的ARGs为floR、aac(6’)-lb7和TEM-150。不同养殖动物粪便中CARP流行情况有一定差异，其中蛋鸡粪中CARP具有更高的转移能力和流行率，但其多重耐药程度要弱于肉鸡和猪粪。共检出49种共有的ARGs，其中64%属于氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和甲氧苄啶类。64株典型接合子的耐药表型也有类似特点，主要对β-内酰胺类（95.31%）、四环素类（89.06%）、氨基糖苷类（87.5%）和氟喹诺酮类（68.75%）抗生素耐药率较高。猪粪中检出IncH型、IncN型和IncR型这3种广宿主范围质粒，猪场中12.5% 接合子携带5个及以上高风险ARGs，比例高于其他养殖场。研究表明，畜禽粪便中CARP普遍携带多种类型的ARGs，使宿主菌具有多种抗生素耐药能力；高风险ARGs被广宿主范围接合型质粒所携带，增加了其由养殖场向周边环境传播的风险。

关键词：畜禽养殖接合型质粒抗生素耐药基因(ARGs) 表型复制子

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

毕赤酵母分泌型遗传操作工具的构建与优化

河北科技大学学报 2024年第4期45卷 415-424页

作者：张梦宇王祎涵李涵李天明冯惠勇河北科技大学食品与生物学院河北石家庄050018

为了解决毕赤酵母遗传操作效率低且流程繁琐的问题,提高其应用价值,构建并优化了分泌型遗传操作工具。首先,以α-淀粉酶为报告蛋白,通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒;其次,借助通用引物和POE-PCR,快速筛选评估与目的蛋白最匹... 详细信息

为了解决毕赤酵母遗传操作效率低且流程繁琐的问题,提高其应用价值,构建并优化了分泌型遗传操作工具。首先,以α-淀粉酶为报告蛋白,通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒;其次,借助通用引物和POE-PCR,快速筛选评估与目的蛋白最匹配的内源信号肽;最后,构建以亚磷酸盐为唯一磷源的营养依赖型筛选标记。结果表明:2种非整合型质粒表达α-淀粉酶的酶活分别是整合型质粒的2倍和1.6倍;以FLO10、EXG1和MSB 2为信号肽引导的α-淀粉酶酶活分别是常规信号肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍;亚磷酸脱氢酶基因(ptxD)成功筛选出异源表达α-淀粉酶的重组菌株。研究简化了基因操作流程,改进了遗传操作工具,开发的绿色安全且低成本的营养依赖型筛选标记,有助于毕赤酵母分泌表达系统的应用和推广。

关键词：合成生物学毕赤酵母分泌表达复制子信号肽筛选标记

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

尼诺库埃病毒复制子和假病毒包装系统的搭建

尼诺库埃病毒复制子和假病毒包装系统的搭建

作者：陈维琼四川农业大学

学位级别：硕士

尼诺库埃病毒(Nienokoue virus,NIEV)属于黄病毒科黄病毒属的蚊黄病毒。黄病毒按照其传播方式的不同,分为昆虫特异性黄病毒、蚊媒黄病毒、蜱媒黄病毒和无已知载体黄病毒。NIEV为经典的昆虫特异性黄病毒,其感染宿主仅限于昆虫;蚊媒黄病... 详细信息

尼诺库埃病毒(Nienokoue virus,NIEV)属于黄病毒科黄病毒属的蚊黄病毒。黄病毒按照其传播方式的不同,分为昆虫特异性黄病毒、蚊媒黄病毒、蜱媒黄病毒和无已知载体黄病毒。NIEV为经典的昆虫特异性黄病毒,其感染宿主仅限于昆虫;蚊媒黄病毒和蜱媒黄病毒是以昆虫为传播媒介进行传播感染。目前,危害动物养殖业的一些重要疫病的病原属于蚊媒黄病毒,其中猪乙型脑炎病毒和鸭坦布苏病毒对我国养殖业造成无法估量的损失,在众多的防治手段中,阻断病毒的传播途径可作为一种防控新思路。由于NIEV只在蚊虫中增殖,因此解析NIEV的复制机制可以为蚊媒黄病毒的防控治疗提供关键信息参考。复制子、假病毒包装系统和感染性克隆等作为黄病毒反向遗传操作分子工具,可用于蚊媒传播阻断的疫苗毒株研发和抗病毒药物筛选。为了服务于黄病毒蚊媒传播阻断型疫苗毒株分子设计平台的需求,本论文以NIEV为研究对象,建立一系列NIEV的实验室工具,包括:鼠抗NIEV NS1多克隆抗血清、携带Nano Luc荧光素酶或m Cherry荧光蛋白的NIEV报告复制子、NIEV假病毒包装系统,简述如下:1.鼠抗NIEV NS1多克隆抗血清的制备为了制备鼠抗NIEV NS1多克隆抗血清,本论文构建了NS1原核表达质粒p ET28-NS1,将p ET28-NS1转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,再对NS1表达菌的诱导时间、温度以及IPTG浓度进行优化。结果显示,在37℃、0.4 m M IPTG的条件下诱导2 h,NS1重组蛋白的表达量最高;NS1重组蛋白表达在包涵体中。将NS1重组蛋白用8 M尿素溶解后,使用镍柱进行亲和纯化。纯化蛋白免疫SPF昆明鼠,4次免疫结束后采集小鼠血清,获得NS1多克隆抗血清。最后通过蛋白免疫印迹和间接免疫荧光试验对抗体进行特异性检测,结果表明鼠抗NIEV NS1多克隆抗血清可以特异性识别真核表达的NIEV NS1蛋白。2.NIEV复制子的构建与应用为了监测NIEV的基因组RNA复制情况,本论文构建了NIEV复制子。黄病毒复制子要分别在蚊子和哺乳动物细胞中起始转录并形成真实的5’末端,则要先筛选到可使用的启动子。本论文构建了分别以CMV、EF1α、SV40、Ubi和Op IE2启动子启动报告基因e CFP和Nano Luc表达的报告质粒,通过检测报告基因的表达情况,明确不同启动子的工作效率。结果显示,在C6/36和BHK21细胞上的最适启动子分别是Op IE2和CMV。接着,分别构建了携带不同启动子和不同报告基因的复制子(Op IE2-NIEV-NLuc-rep、Op IE2-NIEV-m Cherry-rep、CMV-NIEV-NLuc-rep、CMVNIEV-m Cherry-rep)及相对应的复制缺陷型复制子。结果表明NIEV复制子可以在C6/36细胞上翻译和复制,在BHK21细胞仅翻译不复制。进一步将NIEV复制子应用于抗病毒药物筛选,结果显示,沙奎那韦和利巴韦林能抑制NIEV复制子工作,且抑制效果与剂量呈正相关。以上说明,本论文构建的NIEV复制子系统能反应NIEV基因组RNA的复制情况且可应用于抗病毒药物的筛选。3.NIEV假病毒包装系统的搭建为了监测NIEV的吸附进入情况,本论文构建了NIEV假病毒包装系统。将NIEV复制子和病毒结构蛋白NIEV-Cpr ME真核表达质粒共同转染到细胞中,组装形成单轮感染性病毒粒子(single round infectious particles,SRIPs)。为了提升SRIPs的包装效率,本论文优化了两种质粒的比例和转染后的收样时间。结果表明,将包装质粒和复制子以1:5的质粒比例转染到细胞中,转染120 h后收取SRIPs,其包装效率最高。在此基础上,本论文进一步构建了NIEV-Cpr ME稳定表达细胞系,利用稳定表达细胞系包装更有利于SRIPs的大量生产。将SRIPs感染不同的细胞,发现其可以感染C6/36细胞而不感染BHK21细胞,表明本论文包装的SRIPs能够正常工作。NIEV假病毒包装系统的建立,为研发黄病毒蚊媒传播阻断型疫苗毒株提供必要研究工具。综上,本论文通过对启动子、转染比例和转染时间等试验条件的优化,成功搭建NIEV复制子和假病毒包装系统,并且明确其可应用于NIEV抗病毒药物筛选以及揭示NIEV增殖特性的研究,可为研发黄病毒蚊媒传播阻断型疫苗毒株提供必要研究工具。

关键词： NIEV 复制子假病毒包装系统多克隆抗血清药物筛选

通过反向遗传构建SARS-CoV-2复制子

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

通过反向遗传构建SARS-CoV-2复制子

作者：邱泽山东师范大学

学位级别：硕士

2019年12月急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的的持续大流行在世界范围内造成了严重的公共卫生危机和重大的经济损失。为了应对新冠状病毒,迫切需要对SARS-CoV-2生物学进行更多研究,科研人员进行了抗病毒制剂的研发和各种模型的建... 详细信息

2019年12月急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的的持续大流行在世界范围内造成了严重的公共卫生危机和重大的经济损失。为了应对新冠状病毒,迫切需要对SARS-CoV-2生物学进行更多研究,科研人员进行了抗病毒制剂的研发和各种模型的建立。能够自我复制的RNA称为复制子,是用于在不产生传染性病毒的情况下,对RNA病毒生命周期的许多方面进行遗传探究的模型系统,本研究中试图开发一种反向遗传系统来生成复制缺陷病毒(复制子),作为细胞模型为研究抗病毒药物或疫苗进行技术储备。SARS-CoV-2复制子利用了与其他冠状病毒一起开创的体外连接方法,在复制子中插入了稳定的表达绿色荧光蛋白(EGFP)和纳米荧光素酶(Nanoluc)的报告基因,更能直观的对抗病毒制剂和疫苗进行评估。SARS-CoV-2复制子也已用于研究SARS-CoV-2致病的重要病毒成分。这种反向遗传系统为SARS-CoV-2的研究和对策制定提供了关键工具。在本研究中,描述了这种反向遗传系统的构建过程。(1)制作SARS-CoV-2的复制子RNA。首先完成SARS-CoV-2的结构改造,以尽可能降低改造完成的复制子的致病性。在改造的过程中,删掉了SARS-CoV-2的大部分结构蛋白和部分非结构蛋白。并添加了一种绿色荧光蛋白(EGFP)和纳米荧光素酶报告基因,方便对复制子存在和增殖状态的评估。由于SARS-CoV-2的基因组过长,为了便于连接,将基因组分成七个部分(F1-F7),并删去了高致病性的F6片段。提取野生毒株SARS-CoV-2(BJ01)的RNA,反转录得到野生病毒c DNA。设计引物,利用PCR的方式得到病毒基因片段,构建到质粒载体PUC57和PKQLL上;将构建好的质粒扩大培养,进行质粒大提。然后通过酶切的方式得到高浓度的病毒基因片段。通过体外链接将所有的片段连接起来,通过体外转录得到复制子RNA。(2)构建稳定表达N基因的BHK细胞系。首先确认BHK细胞的G418抗生素最高耐受浓度,并确定适于病毒筛选的G418抗生素浓度。通过PCR的方式,以SARS-CoV-2c DNA为模板,得到SARS-CoV-2N基因片段。将N基因插入PCAGGS-G418质粒中,得到PCAGGS-G418-N质粒。将PCAGGS-G418-N质粒转染到BHK细胞中,通过western blot验证N基因在BHK细胞中的表达正确。验证成功后,再做一次质粒转染,然后使用G418抗生素筛选BHK细胞。经过一段时间的筛选,得到了能在G418抗生素中稳定遗传的细胞簇。挑取单个细胞进行扩大化培养,获得了稳定表达N基因的BHK-N细胞系。(3)将复制子RNA电转染到BHK-N细胞系中,验证复制子的表达情况。首先利用EGFP质粒探索电转的实验条件,以尽可能得到更高的RNA转化率。在实验的过程中,使用了BTX830和NECO两种不同的电转仪,经过比较,NECO电转仪的效率比较高,被选为了正式实验的仪器。在电转完成后,比较了电转复制子RNA的细胞与未电转复制子RNA的细胞的各项指标。包括绿色荧光信号的强度,以及荧光素酶强度的比较。以验证复制子的表达情况。

关键词： SARS-CoV-2 复制子 BHK细胞电转化 N蛋白

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

干扰素γ对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用

中华肝脏病杂志 2006年第1期14卷 7-10页

作者：贾因棠魏来蒋栋丛旭费然山西医科大学第一医院感染科太原030001 北京大学人民医院肝病研究所

目的研究干扰素(IFN)γ直接抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制子的作用及其与IFN α联合用药的疗效,并对可能介导IFN γ抗HCV作用的干扰素刺激基因(ISG)的表达水平进行探讨。方法建立HCV复制子细胞模型,用IFN γ或IFN γ联合IFN α处理HCV复制... 详细信息

目的研究干扰素(IFN)γ直接抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制子的作用及其与IFN α联合用药的疗效,并对可能介导IFN γ抗HCV作用的干扰素刺激基因(ISG)的表达水平进行探讨。方法建立HCV复制子细胞模型,用IFN γ或IFN γ联合IFN α处理HCV复制子细胞,通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时定量PCR检测细胞中HCV RNA水平;western blot检测细胞中HCV非结构蛋白5A(NS5A)。结果 IFN γ对HCV RNA的复制及NS5A的表达有明显抑制作用,10 U／ml IFN γ可使 HCV RNA较对照组减少36％,25 U／ml减少80％;IFN γ对HCV RNA及NS5A蛋白的抑制作用与其剂量及作用时间呈正相关。用IFN γ预处理的细胞对IFN α抗HCV的作用更敏感,且细胞内干扰素调节因子 -l(IRF-1)、干扰素刺激基因因子3 γ(ISGF3 γ)和2’5’-寡腺苷酸合成酶(2’5’-OAS)呈明显的诱导性表达。结论 IFN γ能有效抑制HCV RNA的复制,并与IFN α有协同抗HCV的作用。IRF-1、ISGF3 γ和2’5’-OAS可能参与介导IFN γ抗HCV的作用。

关键词：干扰素Ⅱ型肝炎病毒,丙型复制子

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

昆津病毒复制子——一种新型病毒载体

生物工程学报 2011年第2期27卷 141-146页

作者：李世华李晓峰秦鄂德秦成峰军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

病毒复制子(Replicon)是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒(Kunjun virus)为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等... 详细信息

病毒复制子(Replicon)是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒(Kunjun virus)为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等特点,在病毒基因组复制调控机制、外源蛋白表达、新型疫苗和基因治疗等领域得到了广泛应用。以下就昆津病毒复制子系统的构建、特性及应用方面的研究进展作一综述。

关键词：昆津病毒复制子 RNA病毒病毒载体

兔出血症病毒复制子的构建及其在RK-13细胞中的复制

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

病毒学报 2007年第6期23卷 481-484页

作者：刘光清倪征云涛余斌朱金梅华炯钢陈剑平浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所杭州310021 西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

为研究兔出血症病毒(RHDV)的复制机制、病毒与宿主之间的相互作用以及致病机制等,创建一个安全、有效的技术平台,在前期构建的RHDV侵染性克隆基础上,将病毒的衣壳蛋白编码区删除,保留了RHDV复制必需的所有蛋白酶基因和两端的非编码区,... 详细信息

为研究兔出血症病毒(RHDV)的复制机制、病毒与宿主之间的相互作用以及致病机制等,创建一个安全、有效的技术平台,在前期构建的RHDV侵染性克隆基础上,将病毒的衣壳蛋白编码区删除,保留了RHDV复制必需的所有蛋白酶基因和两端的非编码区,构建了RHDV复制子。试验结果证明,将该复制子RNA导入RK13细胞中后,能够进行高水平的复制和表达。

关键词：兔出血症病毒复制子衣壳蛋白 RK-13细胞

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

干扰素α对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用

中华医学杂志 2005年第29期85卷 2065-2069页

作者：贾因棠魏来蒋栋丛旭费然北京大学人民医院肝病研究所 100044

目的利用丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞模型,体外研究干扰素α(IFN-α)对HCV复制子的抑制作用,并探讨 IFN-α信号传导与激活转录分子( STAT )及介导 IFN-α抗病毒作用的干扰素刺激基因(ISGs)的表达水平.方法以HCV复制子质粒为模板体外转... 详细信息

目的利用丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞模型,体外研究干扰素α(IFN-α)对HCV复制子的抑制作用,并探讨 IFN-α信号传导与激活转录分子( STAT )及介导 IFN-α抗病毒作用的干扰素刺激基因(ISGs)的表达水平.方法以HCV复制子质粒为模板体外转录合成HCV复制子RNA, 将此RNA 转染Huh7肝癌细胞并经G418筛选,建立HCV复制子细胞株;用不同剂量(0～5000 IU/ml) IFN-α处理HCV复制子细胞72 h或用1000 IU/ml IFN-α处理细胞不同时间(0、 24、 48、 72、 96h),通过半定量RT-PCR及实时定量PCR同时检测HCV RNA,Western印迹检测HCV NS5A蛋白表达水平,研究IFN-α对HCV复制子的抑制作用.结果 IFN-α能明显抑制HCV RNA的复制,10 IU/ml 及25 IU/ml IFN-α可使HCV RNA较无IFN-α处理的对照细胞分别降低约68%及75%;IFN-α 1000 IU/ml作用24 h或96 h导致HCV RNA较对照组分别降低75%及88%,同样,IFN-α对HCV NS5A蛋白的合成也有明显抑制作用,说明IFN-α的抗HCV作用呈剂量及时间依赖性;HCV复制子细胞中有抗病毒作用的 ISG(PKR、2'5'OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ)呈明显的IFN诱导性表达.结论 IFN-α能明显抑制HCV RNA的复制,其抑制作用与IFN-α剂量及作用时间有关,PKR、2'5'OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ等ISG可能介导IFN-α的抗HCV作用.

关键词：干扰素α C型肝炎样病毒属复制子干扰素刺激基因