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郑州大学学报（医学版） 2023年第3期58卷 310-315页

作者：李锐付昊杰孙晶晶郑廉郑州大学第一附属医院口腔颌面外科郑州450052

目的:观察处理牙本质基质(TDM)浸提液对牙髓干细胞(DPSC)成牙分化的诱导作用及可能机制。方法:取健康离体牙,采用梯度脱矿法制备TDM并收集TDM浸提液。将分离培养的DPSC分为2组,分别用正常培养基(正常对照组)和TDM浸提液(TDM组)培养7 d... 详细信息

目的:观察处理牙本质基质(TDM)浸提液对牙髓干细胞(DPSC)成牙分化的诱导作用及可能机制。方法:取健康离体牙,采用梯度脱矿法制备TDM并收集TDM浸提液。将分离培养的DPSC分为2组,分别用正常培养基(正常对照组)和TDM浸提液(TDM组)培养7 d。采用Western blot法检测2组细胞中成牙相关蛋白(DSPP、DMP-1、Runx2、ALP),GSK3β,磷酸化GSK3β(Ser9)及活化的β-catenin蛋白的表达,采用免疫荧光染色定位活化的β-catenin。结果:与正常对照组比较,TDM组成牙相关蛋白表达均升高,GSK3β磷酸化水平与活化的β-catenin蛋白表达升高(P<0.05);免疫荧光染色结果显示活化的β-catenin定位在细胞核中,且TDM组活化的β-catenin荧光强度强于正常对照组。结论:TDM浸提液可以促进DPSC成牙分化,其机制可能与抑制GSK3β、激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词：牙髓干细胞处理牙本质基质糖原合成酶激酶-3β Wnt/β-catenin信号通路

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处理牙本质基质材料复合α-半水硫酸钙修复骨缺损的实验研究

处理牙本质基质材料复合α-半水硫酸钙修复骨缺损的实验研究

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作者：郭润莹郑州大学

学位级别：硕士

目的肿瘤、创伤等原因导致的骨缺损严重影响患者生活质量。自体骨移植、异体骨移植是临床上常见的治疗方法,但是存在创伤大、易感染等问题。骨移植材料修复大面积的骨缺损是较为理想的一种治疗方法,但是单一组分的人工骨很难满足理想骨... 详细信息

目的肿瘤、创伤等原因导致的骨缺损严重影响患者生活质量。自体骨移植、异体骨移植是临床上常见的治疗方法,但是存在创伤大、易感染等问题。骨移植材料修复大面积的骨缺损是较为理想的一种治疗方法,但是单一组分的人工骨很难满足理想骨修复材料的所有要求。在本研究中,将富含多种生长因子的处理牙本质基质（Treated dentin matrix,TDM）和 α-半水硫酸钙（α-calcium sμ lphate hemihydrate,α-CSH）以不同的质量比进行混合,制备出了处理牙本质基质材料复合α-半水硫酸钙（TDM/α-CSH）。为骨移植材料的制备提供了新的思路。方法本实验主要是由三部分构成。第一部分是材料的制备和表征研究。收集临床上离体牙,EDTA梯度脱矿后,低温冷冻干燥后制备成TDM颗粒。将不同质量比的TDM和α-CSH按照0.4ml/g的液固比进行混合,制备得到TDM/α-CSH复合材料。通过力学测试、扫描电镜（sanning electronic microscopy,SEM）、X射线衍射检测（X-ray diffractometer,XRD）、红外表面官能团分析（fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR）、降解实验、溶血实验对材料的表征进行检验。第二部分为研究复合材料对骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMMSCs）增殖和成骨向分化的影响:首先提取BMMSCs,取提取的P3代BMMSCs用于后续实验。对BMMSCs流式鉴定细胞表面标记物;成骨、成脂诱导鉴定细胞多向分化能力;免疫荧光鉴定细胞来源。然后将复合材料置于α-MEM培养基中,得到各复合材料的浸提液,用以体外细胞实验。通过CCK-8验证浸提液对BMMSCs增殖的影响。实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real time polymerase,qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）验证浸提液对BMMSCs成骨向分化的影响。第三部分为:将制得的复合材料移植入SD大鼠颅骨临界骨缺损模型中,经过Micro-CT检测骨修复情况,然后计算各组新骨形成面积和缺损总面积百分比来观察该复合材料的体内骨组织缺损修复效果。通过HE、Masson检验材料的成骨性能。结果第一部分中,力学测试显示,随着TDM含量的增加,TDM/α-CSH复合材料的机械强度呈现降低的趋势,TDM含量越多,复合材料的抗压强度越低。扫描电镜结果显示,经过EDTA梯度脱矿后得到的TDM片可见牙本质小管充分开放,部分基质中的胶原纤维暴露,使牙本质基质中的胶原纤维束变得比较松弛。证明EDTA梯度脱矿后能够打开牙本质小管。将TDM片磨成TDM颗粒,扫描电镜显示,TDM颗粒为类圆形颗粒,多种类圆形的颗粒互相形成疏松的片状结构。α-CSH为疏松的棱柱状结构,当TDM和α-CSH均匀混合后,可看到在颗粒状的TDM中有α-CSH结构,随着TDM含量增加,棱柱形的α-CSH含量减少,材料更为疏松。FT-IR和XRD分析显示,TDM/α-CSH复合材料为TDM和α-CSH材料的物理混合,在二者混合之后,并无新生物质产生。溶血实验显示,所有的复合材料溶血率均低于5%,证明我们的复合材料不会导致红细胞出现溶血反应,和血液的相容性良好。降解实验显示,复合材料具有降解作用,随着TDM含量增加,材料的降解率增高。第二部分中,我们得到的BMMSCs光学显微镜下显示出细长的多角形形态,经过14天的成脂诱导、21天的成骨诱导,BMMSCs出现了脂滴和矿化结节。流式结果显示,CD29、CD90、CD73表达率高于95%为阳性。而CD31小于5%呈阴性。免疫荧光检测结果表明,间充质表面标记物Vimentin呈现阳性,上皮细胞标记物CK 14呈现阴性。通过CCK-8的结果显示,复合材料对于细胞的增的增殖具有一定的影响作用,随着TDM含量的增高,复合材料对于细胞增殖的促进作用明显增强。qRT-PCR和WB结果表明,各组材料能够促进BMMSCs中骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、矮小相关转录因子 2（runt-related transcription factor-2,RUNX2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的表达。第三部分中,当复合材料被移植入大鼠颅骨临界骨缺损模型内时,通过对Micro-CT三维重建的结果显示空白对照组仅缺损边缘处有少量新骨形成,新骨形成量明显低于各材料组;各组新骨形成面积比较:空白对照组＜α-CSH组＜10%TDM/α-CSH 组＜30%TDM/α-CSH 组＜50%TDM/α-CSH 组,各组之间比较均有统计学差异（p＜0.05）。此外,HE和mas

关键词：骨缺损间充质干细胞成骨分化处理牙本质基质半水硫酸钙

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处理的牙本质基质通过抑制GSK3β的表达影响牙髓干细胞成牙分化的研究

处理的牙本质基质通过抑制GSK3β的表达影响牙髓干细胞成牙分化的...

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作者：刘思睿郑州大学

学位级别：硕士

目的处理的牙本质基质材料（Treated Dentin Matrix,TDM）是一种含有多种生长因子及生物活性物质的理想的支架材料,可以诱导牙源性干细胞牙向分化。在牙齿发育的过程中,需要Wnt/β-catenin信号通路的精准调控。糖原合成激酶3β（Glycoge... 详细信息

目的处理的牙本质基质材料（Treated Dentin Matrix,TDM）是一种含有多种生长因子及生物活性物质的理想的支架材料,可以诱导牙源性干细胞牙向分化。在牙齿发育的过程中,需要Wnt/β-catenin信号通路的精准调控。糖原合成激酶3β（Glycogen synthesis kinase3 β,GSK3β）是 Wnt/β-catenin 信号通路中的一个负性调控因子,它与APC等组成的破坏复合体可以作用于β-catenin,使β-catenin被泛素化降解无法入核发挥作用。本实验发现在TDM诱导的牙髓干细胞（human Dental pulp stem cells,hDPSCs）成牙分化的过程中,GSK3β的表达降低,但它是否参与了这一过程尚需进一步研究。(因此,本研究拟利用TDM诱导hDPSCs研究hDPSCs成牙能力及具体机制,为牙再生提供一种新的方法及理论依据。方法利用课题组前期研究的梯度脱矿的方式制备TDM,通过培养基浸泡3天的方式制备TDM的浸提液。以正常培养基作为对照组,按照浸提液的浓度分为4组:100%TDM组、80%TDM组、60%TDM组、40%TDM组。各组分别诱导hDPSCs。通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测细胞成牙相关基因表达水平;通过蛋白质免疫印迹（Western Blot Assay,WB）检测 GSK3β、Wnt/β-catenin 信号通路的蛋白表达水平以及成牙相关蛋白的表达水平;通过慢病毒转染干扰hDPSCs中GSK3β的表达,并利用qRT-PCR检测细胞成牙相关基因的表达水平,WB检测GSK3β以及Wnt/β-catenin信号通路和成牙相关的蛋白表达水平;利用TDM原位盖髓探索牙本质基质材料作为盖髓剂临床应用的可行性;通过下颌骨培养实验确认TDM浸提液诱导成牙过程中的GSK3β的表达变化并定位其表达位置;最后通过裸鼠异位实验将牙本质基质材料分别复合Ad-NC（过表达GSK3β的hDPSCs 的对照）、Ad-GSK3β（过表达 GSK3β的 hDPSCs）、Sh-NC（敲低表达GSK3β的hDPSCs的对照）、GSK3β-RNAi（敲低表达GSK3β的hDPSCs）,进一步验证TDM诱导hDPSCs成牙分化的机制。结果通过比较正常培养基及浸提液诱导的hDPSCs成牙分化相关基因及蛋白表达能力的差异,发现利用TDM浸提液诱导的hDPSCs的成牙分化能力增强,且在这一过程中GSK3β的表达降低;通过慢病毒构建敲低及过表达GSK3β的hDPSCs,比较 Ad-NC、Ad-GSK3β、Sh-NC、GSK3β-RNAi 成牙相关基因及蛋白表达水平,结果发现GSK3β-RNAi的hDPSCs的成牙相关基因及蛋白的表达最强,而Ad-GSK3β的hDPSCs表达最弱;比较利用TDM和氢氧化钙进行原位盖髓的能力,结果发现TDM盖髓形成的修复性牙本质更加规则;下颌骨培养实验结果发现GSK3β在牙釉质及牙本质内均有表达且在TDM诱导组中形成的修复性牙本质的厚度更厚;通过裸鼠异位成牙实验将TDM分别复合Ad-NC、Ad-GSK3β、Sh-NC、GSK3β-RNAi 的 hDPSCs,结果显示 GSK3β-RNAi组HE染色有新形成的不规则牙本质,其他组无相似结构出现;此外,免疫组化结果显示GSK3β-RNAi组的成牙相关蛋白（DSPP,DMP-1,ALP,RUNX2等）的表达最强,而Ad-GSK3β的hDPSCs表达减弱。结论TDM通过抑制GSK3β的表达激活Wnt/β-catenin信号通路进而增强hDPSCs的成牙分化能力,该结果为牙髓干细胞的成牙分化以及牙根再生提供新的启示。

关键词：牙髓干细胞 Wnt/β-catenin信号通路成牙分化处理牙本质基质 GSK3β

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牙本质基质材料在活髓保存领域中的研究进展

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口腔疾病防治 2024年

作者：戴雨果郭维华四川大学华西口腔医院儿童口腔科四川大学华西口腔医院口腔医学+前沿创新中心昆明医科大学附属口腔医院云南省口腔医学重点实验室

近年来，处理牙本质基质材料（treated dentin matrix，TDM）在活髓保存治疗（vital pulp therapy，VPT）领域的研究和开发应用不断增多。TDM材料含有转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形态发生蛋白2（bone... 详细信息

近年来，处理牙本质基质材料（treated dentin matrix，TDM）在活髓保存治疗（vital pulp therapy，VPT）领域的研究和开发应用不断增多。TDM材料含有转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）等成牙/成骨相关蛋白和因子；对牙源性干细胞具有良好的成牙本质向分化促进作用和良好的生物相容性；在活髓保存领域的设计开发从粉末、糊剂到可注射复合凝胶、凝胶支架等，其成牙本质能力得到越来越多的共识。TDM在动物实验、临床实验中较传统盖髓材料可形成排列良好的成牙本质细胞层、均匀的牙本质小管结构，是其作为VPT材料最大的优势所在。未来TDM在VPT领域应用的挑战主要集中在力学性能的提升与异种材料应用时潜在的免疫排斥问题，应进一步明确TDM的成牙本质通路机制、探索其免疫调控能力；同时，利用TDM构建用于VPT的组织工程支架是具有广阔前景的策略。本文对TDM在活髓保存领域中的研究进展作一综述。

关键词：活髓保存治疗生物材料处理牙本质基质脱矿牙本质基质转化生长因子-β 骨形态发生蛋白2 牙本质再生牙髓-牙本质复合体直接盖髓牙源性干细胞

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