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壳寡糖—硬脂酸嫁接物纳米颗粒对人单核细胞损伤作用研究

壳寡糖—硬脂酸嫁接物纳米颗粒对人单核细胞损伤作用研究

引用

作者：杨洁浙江大学

学位级别：硕士

目的纳米技术是一门新兴的技术,它已广泛应用于生产、生活的各个领域,如新药开发、生物标志物发现和分子诊断技术等。随着纳米技术的迅速发展及纳米材料的大量增多,纳米技术的安全性问题正引起世界范围的重点关注。近年来研究发现不同... 详细信息

目的纳米技术是一门新兴的技术,它已广泛应用于生产、生活的各个领域,如新药开发、生物标志物发现和分子诊断技术等。随着纳米技术的迅速发展及纳米材料的大量增多,纳米技术的安全性问题正引起世界范围的重点关注。近年来研究发现不同途径接触的纳米材料都可以进入血液循环,可能对血细胞及凝血功能产生影响,因此纳米材料对血液系统的潜在毒性也深受关注。聚合物胶团是近几年正在发展的一类新型纳米药物载体,具有增溶、靶向、长循环等优点。壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团(纳米颗粒,CSO-SA)是本校药学院正在研发的纳米载体,期望能够作为抗肿瘤药等药物的载体而优化给药系统。这就使得该纳米颗粒可能被直接注射入血,与血细胞和血管内皮接触,因此对其血液系统毒性的评价至关重要。体内体外研究发现多种纳米颗粒可以诱导活性氧簇(ROS)的过量生成和炎症反应,这可能是纳米颗粒对心血管系统产生有害效应的主要机制。本研究主要观察了CSO-SA纳米颗粒对体外培养的人单核细胞的损伤情况及氧化损伤机制。方法 1.细胞毒性检测用倒置显微镜观察CSO-SA (0.10、20、50、100、200、400、800μg/ml)处理24h后THP-1细胞形态变化;用透射电镜观察20μg/ml CSO-SA处理0、6、12、24h后THP-1超微结构改变。用PI染色法观察CSO-SA (0、10、20、50、100、200、400、800μg/ml)处理24h后和20、50μg/ml CSO-SA处理0、6、12、24h后THP-1的死亡情况。用改良MTT法(CCK-8)检测CSO-SA (0、10、20、50、100、200μg/ml)处理24h后和20μg/ml CSO-SA处理0、6、12、24、36、48h后THP-1细胞的相对存活率。 2.氧化还原状态检测 CSO-SA (0、2、10、20μg/ml)处理细胞24h后,用DCFH-DA法检测THP-1细胞内ROS水平的变化;用Griess Reagent检测THP-1细胞培养上清液中NO水平。 CSO-SA (0、2、10、20μg/ml)处理细胞24h后,用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内和上清液中SOD活力,通过过氧化氢的消耗速度来测定CAT活力,通过还原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量来测定GSH-Px的活力。 3.炎症因子检测用酶联免疫试剂盒(ELISA)检测CSO-SA (0、2、10、20μg/ml)处理24h后THP-1细胞培养上清液中炎症因子TNF-α、 IL-1β的变化。 ***预处理后的变化 NAC500μM预处理THP-1细胞1h后,1)检测CSO-SA (0、2μg/ml)处理24h后THP-1细胞中ROS水平,2)检测CSO-SA (0、2μg/ml)处理24h后THP-1细胞培养上清液中TNF-α、 IL-1β的水平;并检测未用NAC预处理的上述剂量组中各指标的水平,进行比较。 5.所有结果采用SPSS统计软件进行分析结果 1.细胞毒性对照组细胞生长状态良好,细胞多呈圆形或卵圆形,单个、饱满,悬浮生长,大小均一,10-800μg/ml染毒组出现不同程度的细胞形态改变,从50μg/ml染毒组起,死亡破碎的细胞明显增多。透射电镜显示20μg/ml CSO-SA使细胞表面细长突起增多,胞内空泡形成。 0-200μg/ml CSO-SA作用下,THP-1细胞存活率显著下降,存在剂量-效应关系;20μg/ml的CSO-SA作用下,随着时间的推移,THP-1细胞存活率下降,存在时间-效应关系。 2.氧化还原状态细胞内ROS水平在2μg/ml组显著升高,其它剂量组与对照组相比P>0.05;SOD、CAT、GSH-Px活性均有波动,但是趋势不一致。 3.炎症因子检测结果细胞培养上清液中的TNF-α和IL-1p的浓度在各剂量组均显著升高,且TNF-α在0-10μg/ml的浓度范围内存在良好的剂量-效应关系。IL-1β在0-20μg/ml的浓度范围内存在良好的剂量-效应关系。 ***预处理后结果经500μM的NAC预处理1h后,0和20μg/ml CSO-SA处理的细胞与未经NAC预处理的细胞相比：1)细胞中ROS水平显著降低,2)细胞培养上清液中TNF-α和IL-1p的浓度均显著降低。结论 CSO-SA纳米颗粒对体外培养的人单核细胞具有细胞毒性,能够导致细胞活力下降、ROS合成增加,促进炎症因子的释放。提示其对THP-1细胞的毒效应可能是通过氧化应激介导的。

关键词：壳寡糖-硬脂酸嫁接物纳米颗粒细胞毒性氧化应激炎症损伤

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叶酸修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的基因载体研究

叶酸修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的基因载体研究

引用

作者：李晋浙江工业大学

学位级别：硕士

壳聚糖是一种天然的阳离子聚多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性以及无毒性的优点。目前,壳聚糖作为一种新型的非病毒类基因载体,已引起越来越多的药物制剂研究者的重视。但是,壳聚糖作为基因载体的低转染率和低选择... 详细信息

壳聚糖是一种天然的阳离子聚多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性以及无毒性的优点。目前,壳聚糖作为一种新型的非病毒类基因载体,已引起越来越多的药物制剂研究者的重视。但是,壳聚糖作为基因载体的低转染率和低选择性成为其未来临床应用的巨大障碍。因此,开发具有较高转染性能性能的壳聚糖衍生物载体具有重要意义。叶酸-叶酸受体靶向是近年来备受关注的一种新型抗肿瘤机制,它是利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性而实现目的基因的靶向递送。因此,用叶酸对壳聚糖衍生物进行化学修饰,有望提高基因转染的靶向性和转染效率。本课题选用5.0 KDa的低分子量壳聚糖-壳寡糖（chitosan oligosaccharide, CSO）为主要材料,以碳二亚胺（EDC）为缩合剂,将硬脂酸（stearic acid, SA）的羧基共价结合到壳寡糖链的游离氨基上,得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物（CSO-SA）,利用壳寡糖链游离氨基和叶酸分子游离羧基的反应,对壳寡糖-硬脂酸嫁接物进行叶酸修饰,得到叶酸-壳寡糖-硬脂酸嫁接物（FA-CSO-SA）。以三硝基苯磺酸法测定聚合物氨基取代度;以芘荧光法测定聚合物在水中的临界胶团浓度;嫁接物分散于水相,形成嫁接物胶团,微粒粒度与表面电位测定仪测定胶团的粒径和表面电位。并考察叶酸修饰前后聚合物胶团理化性质的变化。以SKOV3 （FR=93%）和A549（FR=（-））细胞系为模型细胞,考察叶酸修饰对聚合物胶团选择性摄取的影响。以荧光质粒DNA （pEGFP-C1）为报告基因,考察嫁接物胶团密接DNA前后粒径与表面电位的变化,以及嫁接物胶团对DNA的密接和保护DNA免受核酶降解的能力。以LipofectamineTM2000为对照,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,考察叶酸修饰对聚合物胶团细胞转染效率的影响。在此基础上,以虫荧光素酶质粒（PLG-3）为报告基因,定量测定细胞转染效率。叶酸竞争性实验进一步考察叶酸修饰对增强的基因转染的影响。采用偶合反应对5.0 KDa的壳寡糖进行疏水性修饰,得到氨基取代度为19.94%的壳寡糖-硬脂酸嫁接物（CSO-SA）,在水中的临界胶团浓度为147.1μg/ml;碳二亚胺法进一步合成了叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物（FA-CSO-SA）,其临界胶团浓度为105.2μg/ml,叶酸修饰后聚合物胶团在水中的自聚能力有所提高。与CSO-SA胶团比较,经叶酸修饰后的FA-CSO-SA胶团,其数均粒径有所增加,表面电位则出现明显的下降。对SKOV3 （FR=93%）和A549（FR=（-））细胞系的摄取实验结果表明,经叶酸分子的修饰后,聚合物胶团对A549细胞的摄取无明显影响,但明显增加了对叶酸受体过量表达的SKOV3细胞短时间内的细胞摄取。以荧光质粒DNA （pEGFP-C1）为报告基因,共孵育法制备嫁接物胶团/DNA复合物纳米粒,粒径分布在100-200nm之间。凝胶电泳阻滞分析表明,嫁接物胶团具有密接、压缩质粒DNA的能力,同时聚合物可保护DNA免受核酶降解。细胞毒性实验表明,CSO-SA、FA-CSO-SA嫁接物在SKOV3细胞系上的细胞毒性IC50分别为115.15μg/mL、217.18μg/mL,在A549细胞系上的IC50分别为201.91μg/mL、298.46μg/mL,细胞毒性均明显小于LipofectamineTM2000。体外细胞转染实验发现,嫁接物胶团载GFP质粒于转染48h有明显绿色荧光蛋白表达,转染96h时表达量达到最大。经叶酸分子修饰后,嫁接物胶团载DNA在SKOV3细胞上的转染水平明显增加,以虫荧光素酶质粒（pLG-3）为模型质粒,对转染水平进行定量比较,得到同样的结果。叶酸竞争性实验表明,培养液中添加游离叶酸后,细胞转染水平明显降低,说明FA-CSO-SA载体增强的基因转染是由于其嫁接物上的叶酸配体与SKOV3细胞表面的叶酸受体特异性结合所致。

关键词：非病毒基因载体壳寡糖-硬脂酸嫁接物叶酸聚合物胶团基因转染

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阳离子嫁接物胶团基因给药系统研究

阳离子嫁接物胶团基因给药系统研究

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作者：赵梦丹浙江大学

学位级别：硕士

随着人类基因组计划的完成,为基因治疗奠定了坚实的基础,基因治疗已成为世界最活跃的研究领域之一。当前,基因治疗的首要问题是如何选择合适的基因导入系统,因为目的基因为高度亲水性的大分子物质,带有负电性,其自身难以穿透细胞膜,进... 详细信息

随着人类基因组计划的完成,为基因治疗奠定了坚实的基础,基因治疗已成为世界最活跃的研究领域之一。当前,基因治疗的首要问题是如何选择合适的基因导入系统,因为目的基因为高度亲水性的大分子物质,带有负电性,其自身难以穿透细胞膜,进入细胞后也容易被核酸酶降解,生物半衰期短。构建安全有效的细胞内基因递送系统,解决基因高效靶向及实现表达调控是药剂工作者的任务之一。目前的基因导入系统研究,可分为病毒载体(viral vector)系统和非病毒载体(non-viral vector)系统两类。病毒载体充分利用病毒高度进化所具有的感染和寄生特性而被广泛有效地应用,但病毒载体存在诸多不足,如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、制备较复杂及费用较高等。以阳离子脂质体、阳离子聚合物为代表的非病毒载体,由于其安全性能高、易于大规模制备等优点,在基因治疗应用中备受瞩目。由两亲接枝共聚物分子在水性介质中自聚集形成的聚合物胶团(polymer micelles,PM),是继乳剂、脂质体、微粒和纳米粒后,近年来研究十分活跃的靶向控释胶粒给药系统。因其具有一些特有的药物载体性质,如小粒径、高载药量、药物的控制释放、生物相容性以及生物膜通透性等特性,被认为是一种潜在的新型靶向给药系统。聚合物胶团通过主动或被动的方式,实现药物的目标靶向。通过“渗透与保留作用”(permeability and retention effect,EPR)可被动靶向肿瘤部位;胶团表面可嫁接配体(如叶酸等),实现药物的主动靶向。

关键词：基因传递系统非病毒基因载体壳聚糖壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团基因转染 pEGFP-C1 LipofectamineTM2000 荧光探针

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