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G3BP1^(-/-)293T细胞系的构建及其影响塞内卡病毒A复制的研究

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中国兽医科学 2023年第8期53卷 977-982页

作者：高雁怩郭承意姜晓琳赵栩白娟南京农业大学动物医学院、农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲... 详细信息

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(G3BP1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明G3BP1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株G3BP1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究G3BP1对SVA复制的影响奠定了基础。

关键词： G3BP1基因基因敲除 293T细胞塞内卡病毒A 复制

稳定表达GM-CSF的重组塞内卡病毒A的构建与鉴定

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中国兽医学报 2023年第10期43卷 2013-2019页

作者：郭笑然韩颖刘帅峰刘小娜雷白时张武超赵款袁万哲河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒,该病毒在我国流行范围越来越广,对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果,本研究以SVA感染性克隆为基础,将猪源GM-CSF-T2A基因通过融... 详细信息

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒,该病毒在我国流行范围越来越广,对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果,本研究以SVA感染性克隆为基础,将猪源GM-CSF-T2A基因通过融合PCR方法插入到SVA的2A和2B之间,成功构建了重组质粒SVA-GM-CSF,将其转染BHK-21细胞进行病毒拯救及传代。结果显示,重组病毒感染BHK-21细胞可以引起明显的细胞病变;经RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入;间接免疫荧光鉴定表明外源基因GM-CSF在该病毒中成功获得了表达。生物学特性分析表明,重组病毒与亲本病毒在BHK-21细胞中具有相似的生长特性,并且该重组病毒在传代过程中具有良好的遗传稳定性。本研究已成功构建了稳定表达GM-CSF的重组SVA,该重组病毒的构建为进一步明确SVA致病机制和研制新型疫苗提供了理论支持与技术指导。

关键词：塞内卡病毒A 感染性克隆 GM-CSF 重组病毒

塞内卡病毒A SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 162-167页

作者：王晨罗愿陈彦希周远成刘骁西南大学动物医学院重庆400000 四川省畜牧科学研究院四川成都610000

为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021。针对VP1基因,设计了1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)... 详细信息

为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021。针对VP1基因,设计了1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)-SVA为模板的SVA的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,本研究建立的荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.0×10^(1)~1.0×10^(6)copies/μL的范围内线性关系良好,相关系数为0.9948。且用该方法对PEDV、TGEV、PDCoV等猪常见的腹泻病样品检测时无扩增,表明其特异性良好;该方法检测下限可达到1.0×10^(1)copies/μL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内变异系数介于0.1%~0.29%之间,组间变异系数介于0.1%~0.81%之间,说明该检测方法重复性较好。上述结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法可以作为SVA的重要诊断技术,有利于SVA的防治。

关键词：塞内卡病毒A 荧光定量PCR SYBR GreenⅠ

塞内卡病毒A结构蛋白T细胞抗原表位的筛选与鉴定

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中国兽医科学 2022年第1期52卷 77-84页

作者：郭丽莹冯霞潘颂佳马军武中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

塞内卡病毒A(Senecavirus A)是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,仔猪感染后死亡率高达30%~70%,给全球养猪业造成了巨大的损失。开展抗原表位的研究对于病原学研究、免疫监测、疾病诊断及表位疫苗设计具有重要意义,细胞免疫作为清除... 详细信息

塞内卡病毒A(Senecavirus A)是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,仔猪感染后死亡率高达30%~70%,给全球养猪业造成了巨大的损失。开展抗原表位的研究对于病原学研究、免疫监测、疾病诊断及表位疫苗设计具有重要意义,细胞免疫作为清除胞内微生物最有效的防御手段,在免疫应答中起到了十分重要的作用。为了筛选塞内卡病毒A结构蛋白T细胞抗原表位,我们构建了真核表达质粒pcDNA3.1-P1,验证体外表达情况后,将其作为DNA疫苗免疫小鼠,通过流式细胞术检测免疫小鼠后刺激淋巴细胞增殖情况,通过酶联免疫斑点试验筛选SVA结构蛋白T细胞抗原表位,最终选择重复率高且效果较好的多肽,经检测,该多肽具有刺激淋巴细胞产生IFN-γ的能力。结果表明,通过对SVA结构蛋白的筛选,发现1号肽(SFDTASGTF)、9号肽(MPFQSLGTY)、11号肽(ITLTFCGPM)、21号肽(TSVDISVPYI)的效果较好,为塞内卡病毒A的T细胞抗原表位。

关键词：塞内卡病毒A 结构蛋白 T细胞抗原表位筛选

猪塞内卡病毒A、猪水疱病毒和口蹄疫病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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动物医学进展 2023年第9期44卷 12-18页

作者：苏博吴志敏张馨月赵涵鲍迪张添琪张嘉钰梁湘雨孟凡茹王开胡桂学吉林农业大学动物医学院吉林长春130118

为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针,建立了可同时检测上述3种病毒的Taq Man三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVD... 详细信息

为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针,建立了可同时检测上述3种病毒的Taq Man三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVDV阳性质粒,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的阳性样品cDNA或DNA无交叉反应,对3种病毒核酸的最低检出限均为10 copies/μL,组内和组间变异系数均小于4%。应用该方法对2019-2022年采集的吉林省部分地区267份病料和本实验室留存的30份猪血清样品进行检测,未检出SVA、FMDV以及SVDV。建立的三重荧光PCR方法有利于对3种病毒进行有效的流行病学调查,可给快速准确鉴别致猪水疱症状病毒性疾病提供诊断方法。

关键词：塞内卡病毒A 猪水疱病毒口蹄疫病毒三重荧光定量PCR

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塞内卡病毒A反向遗传技术及其应用

中国兽医杂志 2023年第6期59卷 102-106页

作者：王奇李紫薇沙洲尼博刘拂晓青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

塞内卡病毒A(SVA)是引起猪口鼻部、蹄冠部水疱样病变,甚至引起新生仔猪急性死亡的新发病毒。SVA是无囊膜的单股、正链RNA病毒,由于其基因组不断发生重组和进化,因此给养猪业造成较大的经济损失。反向遗传作为一种从基因入手开展体外遗... 详细信息

塞内卡病毒A(SVA)是引起猪口鼻部、蹄冠部水疱样病变,甚至引起新生仔猪急性死亡的新发病毒。SVA是无囊膜的单股、正链RNA病毒,由于其基因组不断发生重组和进化,因此给养猪业造成较大的经济损失。反向遗传作为一种从基因入手开展体外遗传学研究的技术,能够在病毒cDNA分子水平上进行基因定向改造,进而借助宿主细胞实现病毒复制、翻译、包装和拯救的目的,最终研究重组病毒的生物学特性。本文就SVA反向遗传技术的研究及其应用进行综合评述,以期为进一步探究SVA复制、表达、调控等分子机制提供思路。

关键词：塞内卡病毒A 反向遗传 cDNA克隆病毒拯救

河北省塞内卡病毒A VP2基因克隆和序列分析

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黑龙江畜牧兽医 2022年第8期 69-71,81页

作者：王晶郭禹赵云环顾文源刘涛翟刚张帅王丙雷左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省动物疫病预防控制中心石家庄050053 瑞普(保定)生物药业有限公司河北保定071000 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为了解河北省塞内卡病毒A(SVA)VP2基因的变异及分子进化情况,试验设计了一对VP2基因扩增引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆测序,利用MEGA 7.0软件对测序获得的VP2基因序列和GenBank上的参考序列进行遗传进化分析,运用MegAlign 5.0软件进行... 详细信息

为了解河北省塞内卡病毒A(SVA)VP2基因的变异及分子进化情况,试验设计了一对VP2基因扩增引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆测序,利用MEGA 7.0软件对测序获得的VP2基因序列和GenBank上的参考序列进行遗传进化分析,运用MegAlign 5.0软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果表明:成功扩增并测序得到VP2基因序列,将该序列上传至GenBank,获得基因登录号为MZ031967,命名为SVA HB-BD株。该毒株与中国毒株核苷酸序列相似性为95.9%~99.6%;与原型毒株SVV-001(DQ64125-7核苷酸)相似性较低,为94.6%;与其他美国毒株(MN812946、MN812947、KC667560、MH704432、MN812938、MN812937、KU954086、NC011349)核苷酸相似性为93.0%~94.6%。SVA HB-BD株与2015—2016年分离毒株亲缘关系较近,处于同一分支,而与2017—2018年分离毒株亲缘关系较远。SVA HB-BD株与广东省分离毒株氨基酸序列相似性较高,并且在VP2蛋白中和表位位点高度保守。说明HB-BD株与中国毒株具有相同起源,并且在不断演变。

关键词：塞内卡病毒A VP2基因 PCR扩增序列分析遗传进化

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猪塞内卡病毒弱毒株的制备及遗传稳定性评价

猪塞内卡病毒弱毒株的制备及遗传稳定性评价

作者：赵司淼海南大学

学位级别：硕士

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)作为小核糖核酸病毒科成员,是猪原发性水疱传染病的病原体之一。2015年我国首次报道SVA相关疫情;迄今为止,已经蔓延中国大陆超过半数省份,SVA感染引发猪水疱性疾病,可导致仔猪跛行及新生仔猪死亡。而现... 详细信息

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)作为小核糖核酸病毒科成员,是猪原发性水疱传染病的病原体之一。2015年我国首次报道SVA相关疫情;迄今为止,已经蔓延中国大陆超过半数省份,SVA感染引发猪水疱性疾病,可导致仔猪跛行及新生仔猪死亡。而现阶段疫苗免疫是未来防控SVA水疱性疾病的发展方向,因此急需开展SVA相关流行病学及疫苗研发工作。本研究对当前SVA遗传进化情况进行表征,再以生物信息学软件对SVA非结构蛋白中影响病毒复制的位点进行辨析,运用反向遗传操作技术制备SVA弱毒株,测定突变毒株的复制滴度及遗传稳定性。本研究具体开展实验内容及结果如下:1表征SVA遗传历程并评价CHN/SVA/HB/2018弱毒株应用潜力对1989至2019年期间SVA全基因组序列进行遗传重组事件检测,随后基于不含重组事件的SVA毒株进行遗传进化分析,明确SVA线性遗传进化路线并表征其系统发育进化历史。排除CHN/SVA/HB/2018毒株重组的可能,并以线性进化及系统发育的角度评价其符合作为我国SVA弱毒疫苗野生型亲本毒株的潜力。2构建SVA反向遗传系统对CHN/SVA/HB/2018毒株进行反转录聚合酶链反应实验,分段扩增全基因组序列片段,并在全基因组片段3’端及5’端位置添加丁型肝炎核酶及锥头状核酶序列。通过限制性内切酶及DNA连接等方法将SVA全基因组片段及核酶连接至带有CMV启动子的真核表达载体pc DNA3.1,构建SVA反向遗传系统并拯救出与野生型SVA相似细胞CPE的感染病毒。3分析SVA非结构蛋白影响病毒复制位点并制备弱毒株以生物信息学软件对CHN/SVA/HB/2018毒株非结构蛋白中影响病毒复制的位点进行解析,并在SVA反向遗传系统上实施位点突变毒株的拯救。最后成功筛选出2个突变体SVA弱毒株,具体为SVA 3C蛋白D84N及C160G单点突变体的弱毒株。2个突变体弱毒株的感染滴度与野生型CHN/SVA/HB/2018毒株相比具有显著的降低差异。4检测SVA突变体弱毒株遗传稳定性对制备的2个突变体弱毒株进行体外细胞传代,通过序列测序评价突变弱毒株的遗传稳定性。结果表明,SVA 3C蛋白D84N突变弱毒株遗传稳定性较差,传毒10代后出现返祖现象。而SVA 3C蛋白C160G突变弱毒株在传毒至20代后,其突变位点未发生回复突变,即SVA 3C蛋白C160G突变弱毒株具有良好的遗传稳定性。本研究在以反向遗传学与生物信息学相互配合应用的背景下,对影响SVA3C蛋白拮抗先天性免疫相关位点实施突变并成功制备突变弱毒株。该弱毒株与野生型亲本毒株相比,病毒滴度显著降低,且遗传稳定性良好。本研究成果对SVA弱毒活疫苗的研发提供重要应用借鉴意义,同时也可对SVA分子病毒学研究成果应用转化提供参考。

关键词：塞内卡病毒A 反向遗传系统弱毒株制备遗传稳定性

塞内卡病毒A VP2蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2021年第9期51卷 1097-1105页

作者：孙培培朱慧欣延君芳刘文文姜平白娟南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为加强塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的鉴别诊断及流行病学监测。本研究以SVA重组VP2蛋白及其对应的辣根过氧化酶(HRP)标记的单克隆抗体,建立了检测SVA抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后,抗原最佳包被浓度为0.25μg/m L,37℃孵育2 h... 详细信息

为加强塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的鉴别诊断及流行病学监测。本研究以SVA重组VP2蛋白及其对应的辣根过氧化酶(HRP)标记的单克隆抗体,建立了检测SVA抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后,抗原最佳包被浓度为0.25μg/m L,37℃孵育2 h后4℃过夜;最佳封闭液为1%BSA,37℃孵育1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,37℃孵育1.5 h;酶标单抗最佳稀释度为1∶1000,37℃作用45 min;TMB最佳显色时间为37℃作用10~15 min。本方法的判定标准:当阻断率(PI)≥41.25%时为阳性,PI≤25.29%时为阴性,25.29%内和批间重复性试验结果显示,变异系数均小于11%。与中和试验的符合率为70.1%。对506份临床猪血清样品的检测结果显示,SVA抗体阳性率达74.5%。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与稳定性,可用于检测血清中的SVA抗体。

关键词：塞内卡病毒A VP2蛋白单克隆抗体阻断ELISA