检索结果-南通市图书馆

一种基于多重PCR的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法的建立

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中华预防医学杂志 2024年第4期58卷 489-496页

作者：苏文哲李岩陆维智谢华萍李魁彪狄飚聂凯王环宇张周斌许松涛广州市疾病预防控制中心病毒免疫部广州510440 山东省疾病预防控制中心传染病防制所济南250000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 广州市疾病预防控制中心主任室广州510440

目的:建立基于多重PCR的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法。方法:通过NCBI网站检索和下载CHIKV的各基因型序列,经序列比对筛选出备选参考序列,使用Primalscheme和Geneious Prime等软件进行引物方案的设计、筛选和人工优化,并使用7份C... 详细信息

目的:建立基于多重PCR的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法。方法:通过NCBI网站检索和下载CHIKV的各基因型序列,经序列比对筛选出备选参考序列,使用Primalscheme和Geneious Prime等软件进行引物方案的设计、筛选和人工优化,并使用7份CHIKV阳性样品对实验流程进行评估。结果:本研究所设计的引物方案可对各阳性样品进行成功扩增;在样品Ct值小于33时,可获得完整编码区序列;样品Ct值达到35时,可获得99.38%的编码区序列;使用多次迭代,逐步校正的拼接策略可将拼接成功率提高5.70%~25.43%。结论:建立的基于多重PCR的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法操作简单,对多个浓度的基孔肯雅病毒阳性临床样品均表现良好。

关键词：基孔肯雅病毒全基因组测序多重PCR 高通量测序

2019年云南省耿马县发热病例中登革病毒、基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染情况分析

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疾病监测 2024年第6期39卷 711-717页

作者：赵丹妮李华昌张汉菊施靖郭继文杨力邓伟杜青云郭晓芳云南省寄生虫病防治所云南普洱665000 临沧市疾病预防控制中心云南临沧677000 耿马县疾病预防控制中心云南耿马677500

目的探讨2019年中缅边境地区云南省临沧市耿马县发热病例感染虫媒病毒的种类,回顾性分析其流行病学与病原学特征,为本地区发热病例的早期诊断及虫媒传染病的防控提供科学依据。方法收集2019年9—10月耿马县定点医院收治的发热病例信息,... 详细信息

目的探讨2019年中缅边境地区云南省临沧市耿马县发热病例感染虫媒病毒的种类,回顾性分析其流行病学与病原学特征,为本地区发热病例的早期诊断及虫媒传染病的防控提供科学依据。方法收集2019年9—10月耿马县定点医院收治的发热病例信息,采集病例血清用美国登革病毒(DENV)NS1抗原检测试剂检测抗原,并提取病毒RNA用三重实时荧光反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行DENV、基孔肯雅病毒(CHIKV)和寨卡病毒(ZIKV)的核酸检测;对DENV阳性样本再用实时荧光RT-PCR法进行血清型分型检测;选取病毒载量较高的样本,对目的基因测序后进行系统进化分析。结果在946份本地发热病例血清样本中,共检出104份DENV阳性(10.99%),其中33份DENV-1,21份DENV-2,36份DENV-3,14份未分型,DENV NS1抗原检测试剂法的假阴性率为20.19%;43份CHIKV阳性(4.54%);6例ZIKV阳性(0.63%)。对阳性RNA进行RT-PCR产物测序,获得8条DENV-1 NS5基因序列,相似性为97.70%~100.00%,均属基因Ⅰ型,与近年来缅甸等东南亚国家的流行株亲源关系较近;获得1条DENV-2 NS5基因序列,属城市基因型,与2013年新加坡输入株进化关系较近;获得4条CHIKV E2基因序列,相似性为99.30%~100.00%,均属中东南非基因型,与同年云南省瑞丽市流行株亲源关系较近。结论2019年中缅边境地区临沧市耿马县发生了登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病的混合流行,在本地发热病例血清中首次检出CHIKV和ZIKV,提示中缅边境地区应提高对登革热、基孔肯雅热及寨卡病毒病等虫媒病毒病的诊断意识,优化虫媒病毒检测方案,尽可能发现潜在传染源,为有效预防和控制中缅边境地区虫媒传染病提供科学依据。

关键词：虫媒病毒登革病毒基孔肯雅病毒寨卡病毒进化分析耿马县

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测基孔肯雅病毒方法的建立

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国际病毒学杂志 2024年第1期31卷 28-32页

作者：罗正汉蒯月璋韩一芳叶福强胡丹王太武汪春晖何君花张锦海东部战区疾病预防控制中心传染病防控一科南京210002 东部战区总医院妇产科南京210018

目的建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)的基因检测技术方法.方法以CHIKV非结构蛋白1(non-structural protein 1,NSP1)基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性.结果在40℃恒温条件下,利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增,该方法最低检出限可达10拷贝/μL,且当CHIKV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性.结论成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法,该方法操作简便、检测限低且特异性好.

关键词：基孔肯雅病毒逆转录-酶促恒温扩增 NSP1基因

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基孔肯雅病毒疫苗研究新进展

海军军医大学学报 2022年第12期43卷 1437-1444页

作者：潘振东赵平海军军医大学(第二军医大学)海军医学系生物医学防护教研室上海200433

基孔肯雅热(CHIKF)是由基孔肯雅病毒(CHIKV)引起的以发热、皮疹和慢性关节痛为主要症状的急性传染病。CHIKF每年在全球100多个国家和地区发病约100万例,已成为重要的全球性公共卫生问题之一。疫苗接种是预防传染病最重要、最有效和最经... 详细信息

基孔肯雅热(CHIKF)是由基孔肯雅病毒(CHIKV)引起的以发热、皮疹和慢性关节痛为主要症状的急性传染病。CHIKF每年在全球100多个国家和地区发病约100万例,已成为重要的全球性公共卫生问题之一。疫苗接种是预防传染病最重要、最有效和最经济的手段,但是由于基础研究和临床试验的资金投入不足以及病毒持续发生适应性突变等原因,导致针对CHIKV的疫苗研发进程总体较为缓慢,迄今还没有CHIKV疫苗被批准用于临床,但已有多种候选疫苗正在进行临床试验。本综述对近年来CHIKV疫苗研究取得的进展进行了概述。

关键词：基孔肯雅病毒基孔肯雅热病毒疫苗病毒样颗粒

基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立

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中国热带医学 2023年第2期23卷 121-125,130页

作者：李春缘刘炅刘纪茹胡潇予曹孟涛陈月田靖任瑞文徐晓立南部战区疾病预防控制中心广东广州510507 广东省虫媒病毒性传染疾病应急技术研究中心广东广州510507 华南农业大学测试中心广东广州510642

目的建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法,为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析,筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列,并以人GAPDH基因为内参照,设计引物... 详细信息

目的建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法,为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析,筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列,并以人GAPDH基因为内参照,设计引物、探针,采用L9(34)正交实验确定最佳反应条件,建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRT-PCR快检方法,并详细分析所建立方法的灵敏度、特异度、重复性及覆盖面。以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品,制作标准曲线,建立绝对定量方法。结果经系统优化,建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR定性、定量检测方法,反应体系包括:基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针,RT/Taq酶混合液,反应缓冲液及阴阳性参考品。所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株,亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果,而与所试其他18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应,检测下限为580拷贝/mL。定量分析表明,在5.80×10^(2)~5.80×10^(10)拷贝/mL范围内,检测荧光信号值与模板浓度具备良好线性关系,其R^(2)=0.9995,扩增效率为E=0.91%。重复性实验表明,定量分析的批内变异系数为0.01~0.07,批间变异系数为0.03~0.11。结论建立了基孔肯雅病毒的实时荧光定量RT-PCR定性、定量快检方法,具备较高的特异度、灵敏度与覆盖面,为定性、定量分析提供了新的技术手段。

关键词：基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR 快速检测

基孔肯雅病毒无血清培养及灭活病毒保护效果的分析

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中国生物制品学杂志 2022年第1期35卷 19-25,32页

作者：王嘉琪彭浩然何燕华赵兰娟任浩王文戚中田赵平唐海琳海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室上海市医学生物防护重点实验室上海200433

目的建立无血清条件下培养基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)的生产工艺,评价灭活CHIKV在小鼠感染模型的保护效果。方法采用无血清培养基(virus production serum-free medium,VP-SFM)适应培养Vero细胞扩增CHIKV,与含血清DMEM培养... 详细信息

目的建立无血清条件下培养基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)的生产工艺,评价灭活CHIKV在小鼠感染模型的保护效果。方法采用无血清培养基(virus production serum-free medium,VP-SFM)适应培养Vero细胞扩增CHIKV,与含血清DMEM培养基扩增CHIKV效果进行比较。用甲醛和β-丙内酯灭活CHIKV,作为免疫抗原,以氢氧化铝为佐剂,分别在第1和14天接种6周龄C57BL/6小鼠,第28天采血,分离血清,检测血清抗体中和效果。在CHIKV Ross毒株感染小鼠模型中,比较免疫小鼠与对照小鼠体重及脑组织病理变化,评价灭活CHIKV对小鼠的保护效果。结果 Vero细胞在VP-SFM中传代稳定性较好,无血清与含血清培养的CHIKV滴度差异无统计学意义(P> 0.05),均达到108PFU/mL。接种甲醛和β-丙内酯灭活CHIKV的小鼠,血清抗体具有中和作用。小鼠滴鼻感染CHIKV Ross毒株,对照组小鼠脑组织出现病变,体重下降,接种灭活CHIKV组小鼠脑组织未出现明显病变,体重未出现下降,两组小鼠体重下降差异有统计学意义(P <0.001)。结论无血清培养Vero细胞适用于CHIKV扩增,灭活CHIKV在C57BL/6小鼠感染模型上具有显著保护效果。

关键词：无血清培养基基孔肯雅病毒灭活保护效果

基孔肯雅病毒nsP1单克隆抗体制备及其在快速检测中的应用

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医学研究生学报 2022年第2期35卷 136-140页

作者：周婷婷杨展常永和周东明朱进郑峰东部战区疾病预防控制中心传染病防控二科南京210002 江苏省军区盐城离职干部休养所门诊部盐城224001

目的基孔肯雅病毒(CHIKV)广泛分布于非洲、南亚以及东南亚地区。文章拟制备抗CHIKV nsP1蛋白单克隆抗体,建立CHIKV的现场快速检测方法。方法合成nsP1编码基因序列,构建原核表达载体pET28a-nsP1,大肠埃希菌表达并纯化获得重组nsP1蛋白,... 详细信息

目的基孔肯雅病毒(CHIKV)广泛分布于非洲、南亚以及东南亚地区。文章拟制备抗CHIKV nsP1蛋白单克隆抗体,建立CHIKV的现场快速检测方法。方法合成nsP1编码基因序列,构建原核表达载体pET28a-nsP1,大肠埃希菌表达并纯化获得重组nsP1蛋白,免疫小鼠后用常规方法制备筛选可稳定分泌nsP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.SDS-PAGE和ELISA鉴定抗体特异性,并建立免疫学检测方法。结果成功获得了6株阳性细胞株,纯化和筛选得到特异性良好的抗nsP1配对单克隆抗体,建立的双抗夹心ELISA法能特异性检测nsP1抗原,并在此基础上建立了可快速检测CHIKV的胶体金免疫层析方法。结论成功建立了针对CHIKV抗原的免疫学检测方法,为CHIKV感染早期诊断增加了技术储备。

关键词：基孔肯雅病毒 nsP1蛋白单克隆抗体胶体金

基孔肯雅病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原检测方法的初步建立

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基孔肯雅病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原检测方法的初步建立

作者：刘高文昆明理工大学

学位级别：硕士

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)一种虫媒病毒,可引起基孔肯雅热,进一步可发展为急性和慢性衰弱性关节炎疾病,是一种人畜共患疾病。感染急性期表现为突发性的高热(>39℃),并伴有红斑性斑丘疹、肌痛和关节痛,慢性期为持续性或复发性的... 详细信息

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)一种虫媒病毒,可引起基孔肯雅热,进一步可发展为急性和慢性衰弱性关节炎疾病,是一种人畜共患疾病。感染急性期表现为突发性的高热(>39℃),并伴有红斑性斑丘疹、肌痛和关节痛,慢性期为持续性或复发性的关节炎,慢性期可长达几月到几年不等。据报道CHIKV感染者中约50%-60%发展为慢性疾病,经济负担估计每名患者每年25000英镑。建立早期快速诊断方法已经迫在眉睫。基于RT-PCR的诊断方法虽然尤其独特的优势,但也受实验设备,专业技术人员等因素的限制。然而,抗原检测具有特异性强,快速,便捷等优势,在新发传染病检测中再次被广泛关注。由于云南地理位置与生态环境极其适合白纹伊蚊的生存,且云南与老挝、缅甸等CHIKV高风险地区接壤,面临着CHIKV跨境输入的风险。CHIKV、DENV、ZIKV均属于虫媒病毒,流行区域存在交叉感染,共感染且临床症状相似。因此,云南省的基孔肯雅疫情防控形势不容乐观。目前,国内还没有获批可用于临床检测的CHIKV抗原检测方法。因此开发CHIKV抗原检测方法具有重要应用价值。本论文的主要研究结果及结论如下:(1)rE2蛋白的表达纯化。以基孔肯雅病毒E2(1-1038 bp)基因作为靶基因,成功克隆至p ET28a中。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶诱导,成功在Rosetta(DE3)中表达了rE2蛋白。利用His标签亲和树脂纯化蛋白,rE2蛋白经SDS-PAGE、Western Blot验证。结果表明,成功获得40 k Da大小的蛋白,为动物免疫奠定基础。(2)获取单克隆抗体。利用杂交瘤技术筛选稳定细胞系,共获得三株抗体细胞株,并命名为:1B7-H7、2A2-E10和4D3-E8。单抗腹水经Protein A亲和纯化后,对其进行特异性、抗体亚型、中和活性等特性验证。结果表明:(a)所获得的三株单克隆抗体无体外中和活性。(b)三株单克隆抗体经ELISA、IFA、Western Blot试验,均能很好地识别rE2蛋白。与此同时,他们与四种血清型的DENV、ZIKV无交叉反应,特异性100%。这些抗体具有良好的血清学诊断潜力,为后续建立CHIKV抗原检测方法提供了实验材料。(3)建立DAS-ELISA检测方法。将三株单克隆抗体进行HRP偶联后,直接ELISA验证活性,结果显示2A2-E10(HRP)活性最好。因此利用2A2-E10(HRP)为检测抗体,兔多克隆抗体包被ELISA板用于特异性捕获抗原。建立DAS-ELISA检测方法,并对其进行充分评估。实验结果表明:DAS-ELISA检测方法特异性良好,检测下限为1×10～6PFU/m L。总之,本论文建立了DSA-ELISA抗原检测方法,可作为CHIKV早期感染的高通量筛查方法,为有效的控制疫情、及时治疗提供有力保障,符合当下云南省乃至中国对CHIKV早期诊断的需求。

关键词：基孔肯雅热基孔肯雅病毒重组E2蛋白多抗单抗夹心ELISA

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云南省沧源县人基孔肯雅病毒感染调查

中国热带医学 2023年第12期23卷 1249-1253页

作者：李楠孟锦昕李玲丽何于雯王静林云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 沧源县人民医院云南沧源677400

目的为初步了解云南省南部边境地区沧源县基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)的感染情况,为基孔肯雅热防控提供参考依据。方法本研究于2020年4月在云南省沧源县人民医院收集就诊人群血清样本400份,其中,健康体检人群血清样本121份,... 详细信息

目的为初步了解云南省南部边境地区沧源县基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)的感染情况,为基孔肯雅热防控提供参考依据。方法本研究于2020年4月在云南省沧源县人民医院收集就诊人群血清样本400份,其中,健康体检人群血清样本121份,发热患者血清样本279份。采用血清微量中和试验方法,对所收集的就诊人群血清样本进行CHIKV中和抗体检测,采用实时荧光定量反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法对样本进行CHIKV核酸检测,并对结果进行统计分析。结果中和抗体检测结果表明,400份就诊人群血清样本中,CHIKV中和抗体阳性18份,血清总体阳性率为4.5%(18/400);其中,279份发热患者血清样本中,CHIKV中和抗体阳性18份,血清阳性率为6.45%(18/279),中和抗体滴度为1∶10~1∶320;121份健康人群血清样本检测结果均为CHIKV中和抗体阴性。荧光定量RT-PCR结果显示,400份就诊人群血清样本中,共检测到3份为CHIKV核酸阳性,阳性率为0.75%(3/400);其中,279份发热患者血清样本中,CHIKV核酸阳性3份,阳性率为1.08%(3/279),Ct值为36.58~37.74;所有健康人群血清样本检测结果均为CHIKV核酸阴性。结论云南省南部边境地区沧源县人群已经存在CHIKV的感染,并出现疾病的流行,有必要加强该地区CHIKV的监测及防控。

关键词：基孔肯雅病毒中和抗体荧光定量RT-PCR 沧源县