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KLF6调控sublytic C5b-9刺激GMC诱导趋化因子生成的机制研究

KLF6调控sublytic C5b-9刺激GMC诱导趋化因子生成的机制研究

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作者：刘玉南京医科大学

学位级别：硕士

第一部分 Thy-1肾炎大鼠肾组织（体内）和体外用sublytic C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞（GMC）诱导转录因子KLF6与趋化因子（MCP-1 和 Rantes）的表达目的:检查Thy-1肾炎（Thy-1 nephritis,Thy-1N）大鼠肾组织（体内）和体外用亚溶解型... 详细信息

第一部分 Thy-1肾炎大鼠肾组织（体内）和体外用sublytic C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞（GMC）诱导转录因子KLF6与趋化因子（MCP-1 和 Rantes）的表达目的:检查Thy-1肾炎（Thy-1 nephritis,Thy-1N）大鼠肾组织（体内）和体外用亚溶解型（sublytic）C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）产生转录因子 kruppel 样因子 6（kruppel like factor 6,KLF6）以及趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1）和正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,Rantes）的基因表达水平和表达时相,分析上述因子产生之间的相关性。方法:复制大鼠Thy-1N模型,同时体外培养大鼠GMC并给予sublytic C5b-9 刺激,通过 Real-time PCR、Western blot 及 ELISA 检査 Thy-1 N 发病不同时间点的肾组织及不同处理的GMC中KLF6、MCP-1和Rantes的基因表达情况。结果:Thy-1N发病大鼠的肾组织中,KLF6的蛋白表达水平在5h到达峰值,MCP-1和Rantes的蛋白分泌水平在实验6h时均显著上调。此外,体外用sublytic C5b-9刺激培养的GMC,KLF6的蛋白表达在刺激后3h显著增多,而MCP-1和Rantes的分泌水平在5h明显上升。结论:Thy-1N大鼠的肾组织及受sublytic C5b-9刺激后GMC产生KLF6、MCP-1和Rantes的均显著增加,且KLF6升高时相略早于MCP-1和Rantes。提示,大鼠Thy-1N发病时,受sublytic C5b-9刺激的GMC可明显上调转录因子（KLF6）和趋化因子（MCP-1和Rantes）的基因表达,且这些因子之间可能存在着一定的关系。第二部分KLF6调控sublytic C5b-9刺激GMC诱导趋化因子MCP-1和Rantes转录与表达目的:研究转录因子KLF6对sublytic C5b-9刺激GMC诱导趋化因子（MCP-1和Rantes）的调控作用,并筛选KLF6在MCP-1和Rantes基因启动子上可能的结合区域。方法:首先,应用分子克隆技术构建KLF6过表达质粒（pIRES2-KLF6）以及KLF6发夹状小干扰RNA（shRNA）真核质粒。然后,将上述质粒分别转染GMC后再行sublytic C5b-9刺激,用Real-time PCR和ELISA检查过表达或沉默KLF6基因后对sublytic C5b-9刺激GMC诱导MCP-1和Rantes生成的影响。之后,用分子克隆技术构建MCP-1和Rantes基因启动子全长荧光素酶报告质粒（pGL3-MCP-1-FL与pGL3-Rantes-FL）,转染GMC后行荧光素酶报告基因实验（luciferase reporter assay）,检查sublytic C5b-9刺激的 GMC上调MCP-1 和 Rantes基因启动子的活性及KLF6过表达或沉默对上述两基因启动子活性的影响。然后,用生物信息学软件预测MCP-1和Rantes基因启动子上KLF6潜在的结合位点,并据此分别构建出4个相应基因启动子截短的荧光素酶报告质粒（pGL3-MCP-1-1～4 与 pGL3-Rantes-1～4）。将上述 MCP-1 和 Rantes 基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒分别转染GMC,再行荧光素酶报告实验测定sublytic C5b-9刺激及KLF6过表达对GMC上调MCP-1和Rantes基因启动子活性的影响。最后,用染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验确证大鼠MCP-1和Rantes基因启动子上KLF6的结合部位。结果:（1）KLF6过表达能显著增加GMC中MCP-1和Rantes的mRNA和蛋白水平以及相应基因启动子活性,而沉默KLF6基因可明显抑制sublytic C5b-9刺激GMC诱导MCP-1和Rantes基因表达及其基因的启动。（2）pGL3-MCP-1-FL、pGL3-MCP-1-1～4分别给予sublytic C5b-9刺激或与过表达KLF6共转染GMC后,pGL3-MCP-1-4的启动活性显著降低。同样,pGL3-Rantes-FL、pGL3-Rantes-1～4分别给予sublytic C5b-9刺激或与过表达KLF6共转染GMC后,pGL3-Rantes-4的启动活性显著降低。

关键词： Thy-1肾炎(Thy-1N) 亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9) 肾小球系膜细胞(GMC) kruppel样因子(KLF6) 单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) 正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白(Rantes) sublytic C5b-9 GMC KLF6 MCP-1 Rantes 启动子活性基因过表达或沉默

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