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小粒径Fe_(3)O_(4)-DMSA-PEI磁性纳米颗粒的制备及其基因负载能力研究

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无机材料学报 2024年第5期39卷 517-524页

作者：蔡和庆韩璐杨松松薛新玉张扣孙志成刘儒平胡堃危岩北京印刷学院印刷与包装工程学院北京102600 清华大学生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室北京100084

四氧化三铁(Fe_(3)O_(4))磁性纳米颗粒因其制备简单,在外加磁场作用下具有靶向性,并且表面易接枝等特性,可作为被动靶向载体应用于基因治疗领域。本研究采用溶剂热法制备纳米颗粒,并调控堆积生长时间,制得粒径在4~9 nm范围内可控的油相F... 详细信息

四氧化三铁(Fe_(3)O_(4))磁性纳米颗粒因其制备简单,在外加磁场作用下具有靶向性,并且表面易接枝等特性,可作为被动靶向载体应用于基因治疗领域。本研究采用溶剂热法制备纳米颗粒,并调控堆积生长时间,制得粒径在4~9 nm范围内可控的油相Fe_(3)O_(4)纳米颗粒;使用内消旋-2,3-二巯基丁二酸(DMSA)二次取代其表面的油酸分子,使其具备良好的水相分散性;通过酰胺化反应在其表面接枝支链型聚乙烯亚胺(PEI),最终得到Fe_(3)O_(4)-DMSA-PEI磁性纳米颗粒。研究发现,Fe_(3)O_(4)-DMSA-PEI磁性纳米颗粒的表面Zeta电位高达(52.50±1.94)mV,具有一定的超顺磁性(14.48 emu/g,1 emu/g=1 A·m^(2)/kg)。磁性纳米颗粒与质粒DNA的质量比为15:1时可完全阻滞DNA在凝胶上的电泳,装载量高达6.67%。本研究制备的Fe_(3)O_(4)-DMSA-PEI磁性纳米颗粒具有一定的基因负载能力,有望作为基因载体应用于基因转染领域。

关键词：四氧化三铁磁性纳米颗粒基因载体表面改性

基于低分子量PEI的不同疏水链修饰的梳状低聚物基因载体

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科学技术与工程 2023年第19期23卷 8107-8113页

作者：荀苗苗袁长春傅凯张海燕马文兵王志强李志春中北大学化学与化工学院太原030051 中北大学德州产业技术研究院德州253034

为了探究基于低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)基因载体的转染效率,通过Michael加成反应将PEI 600 Da接枝于含有疏水链的生物可降解聚酯上形成系列梳状聚合物,并将之应用于基因载体;利用核磁氢谱和凝胶渗透色谱对聚合物的化学... 详细信息

为了探究基于低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)基因载体的转染效率,通过Michael加成反应将PEI 600 Da接枝于含有疏水链的生物可降解聚酯上形成系列梳状聚合物,并将之应用于基因载体;利用核磁氢谱和凝胶渗透色谱对聚合物的化学结构与分子量进行了测定,此外,还利用凝胶电泳实验和绿色荧光蛋白实验研究了聚合物与DNA的结合能力及其复合物的转染性能。结果表明:本文方法成功合成了系列低聚物,并对DNA表现出较好的包裹能力;油酸修饰后的低聚物与DNA复合物在质量比为6.4时转染效果与PEI 25 kDa相当。可见,油酸修饰后的脂质体低聚物有作为非病毒基因载体的前景。

关键词：基因载体生物可降解疏水性低分子量PEI

富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽体内外mRNA基因递送能力及安全性评价

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药学学报 2024年第4期59卷 1079-1086页

作者：王一醇蒲艺瑶毕群杰宋相容金蓉蓉聂宇四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心/四川大学生物医学工程学院四川成都610064 四川大学生物治疗全国重点实验室四川成都610041

mRNA基因治疗因其可扩展、修饰,不需要进入细胞核及不整合宿主遗传基因等优势而备受关注。在基因治疗中,将mRNA安全有效地递送到细胞内对于基因治疗的成功至关重要。本研究基于前期设计合成的富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽(dendri... 详细信息

mRNA基因治疗因其可扩展、修饰,不需要进入细胞核及不整合宿主遗传基因等优势而备受关注。在基因治疗中,将mRNA安全有效地递送到细胞内对于基因治疗的成功至关重要。本研究基于前期设计合成的富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽(dendritic arginine&disulfide bond-containing cationic lipopeptide,RLS)基因载体在斑马鱼体内成功实现比商品化试剂Lipofectamine 2000高1.5倍的mRNA转染效果,并通过体外细胞毒性和斑马鱼体内生物安全性研究证实其具有良好的生物安全性。首先,通过核磁共振氢谱(1H NMR)及飞行时间质谱(MALDI-TOF)对阳离子脂质肽的化学成分进行表征。通过动态光散射粒度分析仪(DLS)测试的粒径和电位结果显示,在氮磷(N/P)比为20时,RLS与mRNA复合组装体形成平均粒径约220 nm、表面ζ电位约+21 mV的均匀纳米粒子。体外基因转染中,RLS在人胚肾293细胞(HEK293)和大鼠间充质干细胞(MSC)中的转染效率较Lipofectamine 2000分别提高1.2和3倍。此外,将RLS显微注射至斑马鱼胚胎后,通过评价生存率、孵化率和致畸率等指标,进一步证实了其在体内良好的安全性。综上所述,该富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽RLS具有优良的mRNA递送性能和安全性。

关键词：支化精氨酸两亲性阳离子脂质肽基因载体 mRNA递送斑马鱼

靶向常染色质的AGM-CBA基因载体复合物的构建与性能评价

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靶向常染色质的AGM-CBA基因载体复合物的构建与性能评价

作者：任昱曈中国医科大学

学位级别：硕士

目的:设计一种基于胍基化含二硫键的聚氨基胺类聚合物（AGM-CBA）的靶向常染色质的基因递送系统HP1γ/p DNA/AGM-CBA,引入了常染色质靶向蛋白HP1γ从而提高基因递送系统的靶向效率。本文主要研究该复合物的组装、体外转染效率、细胞毒... 详细信息

目的:设计一种基于胍基化含二硫键的聚氨基胺类聚合物（AGM-CBA）的靶向常染色质的基因递送系统HP1γ/p DNA/AGM-CBA,引入了常染色质靶向蛋白HP1γ从而提高基因递送系统的靶向效率。本文主要研究该复合物的组装、体外转染效率、细胞毒性以及细胞内传递途径等性能,为常染色质靶向基因递送研究奠定理论基础。研究方法:1.在复合物组装阶段,采用紫外分光光度法确定最佳HP1γ/p DNA投料比。2.通过插层法确定不同N/P比时AGM-CBA对于HP1γ/p DNA的包封率。3.组装成功后使用动态光散射法（DLS）和透射电子显微镜（TEM）研究其粒径、电位和形态学特征。4.采用琼脂糖凝胶电泳（AGE）法检测聚合物包载HP1γ/p DNA的稳定性和质粒释放能力。5.选取MCF-7细胞,用CCK-8法分析评定HP1γ/p DNA/AGM-CBA的安全性。6.采用流式细胞术（FCM）和荧光显微镜（FM）分析其体外转染效率。7.采用激光扫描共聚焦显微镜（LCSM）对复合物包载HP1γ/p DNA的体外摄取过程、内涵体逃逸过程和核定位效应进行研究。8.通过用转运抑制剂预处理细胞,分析复合物进入细胞的途径。结果:1.AGM-CBA对于HP1γ/p DNA的包封率随着聚合物用量的增多而升高,在N/P=1/8时已经达到50%以上。2.AGM-CBA包载HP1γ/p DNA后复合物粒径仍处于纳米级别,HP1γ的存在会对颗粒直径产生影响,但粒径仍然保持在1μm以内。3.AGM-CBA对HP1γ/p DNA的包载能力以及抵抗肝素和DNaseⅠ酶的能力均优于两种阳性对照载体。4.在一定的N/P比范围内,HP1γ/p DNA/AGM-CBA复合物表现出可控的细胞毒性。5.在最优N/P比条件下,p DNA/AGM-CBA、HP1γ/p DNA/AGM-CBA转染效率均显著超过推荐比例下的阳性对照载体,并且HP1γ的引入在N/P≤1/48时,对转染效率的影响可忽略不计。6.复合物进入细胞的速度明显大于两种阳性对照载体,其中HP1γ的存在可以增高p DNA进入细胞的总量。7.HP1γ结合p DNA后不会影响其转运机制,HP1γ/p DNA/AGM-CBA可能是主要通过其他非经典途径进入细胞,并且可能与网格蛋白的活性呈负相关。8.HP1γ/p DNA/AGM-CBA存在明显且彻底的内涵体逃逸过程,包载的p DNA能够集中分布于核仁区域。结论:AGM-CBA阳离子聚合物载体可以在最适N/P比（1/48）条件下,在MCF-7细胞内有效递送HP1γ/p DNA,并且其细胞毒性仍在可控范围内;它们可以通过静电相互作用有效地包载外源基因,使其穿过细胞膜并快速地从内涵体逃出,集中分布于核仁区域。实验结果证明这种靶向常染色质的基因递送系统具有潜在的临床应用前景。

关键词：靶向基因治疗基因载体常染色质转染效率内涵体逃逸

基于三七多糖的纳米基因载体负载shPD-L1用于肿瘤免疫基因治疗的研究

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基于三七多糖的纳米基因载体负载shPD-L1用于肿瘤免疫基因治疗的...

作者：马梦雅郑州大学

学位级别：硕士

程序性死亡配体1(Programmed Death Ligand 1,PD-L1)是重要的免疫检查点分子,基于PD-L1阻断的肿瘤免疫治疗为癌症患者的长期生存和完全治愈带来了可能。直接作用于靶基因的基因治疗策略可以在基因水平降低PD-L1表达,进而从根本上阻断免... 详细信息

程序性死亡配体1(Programmed Death Ligand 1,PD-L1)是重要的免疫检查点分子,基于PD-L1阻断的肿瘤免疫治疗为癌症患者的长期生存和完全治愈带来了可能。直接作用于靶基因的基因治疗策略可以在基因水平降低PD-L1表达,进而从根本上阻断免疫检查点分子之间的相互作用,成为当前备受关注的PD-L1阻断策略。但由于缺乏安全有效的基因递送载体,基因疗法的临床应用仍然受到限制。近年来,中药多糖成为纳米基因载体研究的热点,三七多糖(Panax notoginseng polysaccharides,PNP)是从中药三七中提取的多糖成分,不仅具备构建基因载体的结构基础,还具有广泛的药理活性,尤其是免疫激活和抗肿瘤作用,这就提示其可能作为一种具有活性的基因载体在肿瘤免疫基因治疗中发挥积极作用,但关于三七多糖作为基因载体用于肿瘤免疫基因治疗的研究鲜有报道。基于此,本课题将小分子聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)接枝到PNP骨架,制备了一种基于PNP的阳离子纳米基因载体PNP-PEI。接着,以靶向PD-L1基因沉默的质粒shPD-L1为模型药物,构建PNP-PEI/shPD-L1纳米给药系统用于肿瘤免疫基因治疗。一方面,该纳米给药系统利用PNP-PEI的载体作用,可以将shPD-L1安全高效地递送至肿瘤细胞并降低PD-L1表达,进而抑制肿瘤免疫逃逸,增强抗肿瘤免疫反应;另一方面,PNP赋予PNP-PEI载体一定的免疫激活和抗肿瘤活性,有助于提高机体抗肿瘤免疫应答,使纳米给药系统发挥高效的治疗效果。本课题具体研究内容主要有以下几个部分:(1)PNP-PEI载体的制备与表征。本研究首先利用高碘酸钾氧化和席夫碱反应将PEI接枝到PNP上,构建阳离子化PNP(PNP-PEI)。通过傅里叶红外光谱、核磁共振氢谱、X射线光电子能谱以及动态光散射等表征手段,证实PNP-PEI纳米载体构建成功,电位为(34.63±2.32)mV,粒径为(210.63±14.63)nm。随后,通过测定不同载体/核酸质量比的PNP-PEI/DNA的粒径电位变化、进行琼脂糖凝胶电泳实验以及透射电镜观察,研究了PNP-PEI与核酸的相互作用,结果表明,PNP-PEI具有高效的核酸负载能力,当其与DNA质量比为9:1或更高时,可完全负载DNA,形成类球状纳米颗粒。(2)PNP-PEI/shPD-L1的体外抗肿瘤活性研究。首先,以小鼠恶性黑色素瘤细胞B16-F10为模型,考察了PNP-PEI/DNA的细胞摄取情况,并以绿色荧光蛋白质粒(p EGFP,Green Fluorescent Protein Expression Plasmid)为报告基因,考察PNP-PEI/p EGFP的转染效率。研究结果表明,PNP-PEI不仅可携带外源核酸进入细胞,同时能够高效表达目的基因。细胞增殖实验结果表明,PNP-PEI载体对肿瘤细胞增殖具有一定抑制作用,但是对巨噬细胞增殖没有明显作用。随后,以PNP-PEI负载shPD-L1构建免疫基因治疗纳米给药系统PNP-PEI/shPD-L1,并考察其体外抗肿瘤活性。实验结果显示,PNP-PEI/shPD-L1可显著抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并有效降低肿瘤细胞中PD-L1的表达,mRNA水平和蛋白水平的沉默效率分别为(83.87±1.58)%和(60.87±2.93)%。最后,基于巨噬细胞与树突状细胞,考察了PNP-PEI/shPD-L1的免疫增强活性,实验结果显示,PNP-PEI/shPD-L1不仅能够显著提高巨噬细胞吞噬能力、促进M2型巨噬细胞向M1型逆转并增强M1型巨噬细胞的极化,而且还能够有效促进树突状细胞的增殖和成熟。(3)PNP-PEI/shPD-L1的体内抗肿瘤活性研究。首先利用荷瘤小鼠模型考察了PNP-PEI/DNA纳米复合物的体内分布。活体成像结果显示,PNP-PEI具有肿瘤靶向性,其与DNA结合后可以携带DNA随血液循环到达肿瘤部位并聚集。随后,建立荷B16-F10恶性黑色素瘤小鼠模型,考察给药系统PNP-PEI/shPD-L1的体内抗肿瘤活性。结果显示,载体PNP-PEI表现出一定的体内抗肿瘤活性。与PNP-PEI相比,纳米给药系统PNP-PEI/shPD-L1的体内抗肿瘤活性显著提高,抑瘤率由35.65%提高到77.74%,目标基因PD-L1在mRNA和蛋白水平的沉默效率分别为(72.20±5.81)%和(51.58±2.44)%。进一步的免疫增强作用机制研究发现,PNP-PEI可以有效促进小鼠血清中白介素12和干扰素γ的分泌,增强小鼠脾细胞以及腹腔巨噬细胞的抗肿瘤活性,提高脾脏组织CD8+T细胞数量,进而增强机体抗肿瘤免疫应答,并显著抑制肿瘤肺转移。最后,小鼠体重、血液指标以及脏器指数等研究结果显示,PNP-PEI/shPD-L1对小鼠无明显毒副作用,表明该纳米给药系统具有良好的生物安

关键词：三七多糖基因载体抗肿瘤免疫基因治疗

一种基于二氧化硅微颗粒的基因载体的制备新方法

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高等学校化学学报 2006年第5期27卷 845-848页

作者：林霞何晓晓王柯敏谭蔚泓湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室化学化工学院生物医学工程中心湖南省生物纳米工程技术研究中心长沙410082

建立了一种基于二氧化硅微颗粒的基因载体的制备新方法.首先将正硅酸乙酯在乙醇和氨水环境下水解,合成得到二氧化硅微颗粒,然后通过静电作用将多聚赖氨酸修饰到硅微颗粒上,制备出可有效地结合DNA的基因载体.所制备的基因载体可将绿色荧... 详细信息

建立了一种基于二氧化硅微颗粒的基因载体的制备新方法.首先将正硅酸乙酯在乙醇和氨水环境下水解,合成得到二氧化硅微颗粒,然后通过静电作用将多聚赖氨酸修饰到硅微颗粒上,制备出可有效地结合DNA的基因载体.所制备的基因载体可将绿色荧光蛋白表达载体pEGFP导入COS-7细胞中,实现了绿色荧光蛋白的高效表达.本方法简便、快速,在基因转染与基因治疗研究领域具有较好的潜在应用价值.

关键词：二氧化硅微颗粒基因载体多聚赖氨酸

胆固醇修饰的低分子量聚乙烯亚胺接枝化聚[L-天冬酰胺-co-L-赖氨酸]作为基因载体的性能研究

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高等学校化学学报 2008年第10期29卷 2011-2014页

作者：王燕铭张振方于琦王连永孔德领俞耀庭南开大学生命科学学院生物活性材料教育部重点实验室天津300071

通过将低分子量的聚乙烯亚胺(PEI600)及其胆固醇衍生物与聚(L-天冬酰胺-co-L-赖氨酸)(PSL)进行开环反应,合成了一类新型的肿瘤靶向基因载体,研究了这类载体与DNA形成复合物的性质以及介导绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1转染不同细胞的性能.... 详细信息

通过将低分子量的聚乙烯亚胺(PEI600)及其胆固醇衍生物与聚(L-天冬酰胺-co-L-赖氨酸)(PSL)进行开环反应,合成了一类新型的肿瘤靶向基因载体,研究了这类载体与DNA形成复合物的性质以及介导绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1转染不同细胞的性能.结果表明,在复合质量比大于5∶1时,各载体均能与DNA形成结构稳定的复合物.同时转染实验结果证明,通过在侧链引入一定数目的胆固醇,可以明显提高载体对于癌细胞HepG2和Hela的转染效率.这类新型的载体具有良好的细胞相容性、较高的转染效率以及易于进行靶向修饰等特点,在基因治疗研究领域中将具有较好的潜在应用价值.

关键词：聚[L-天冬酰胺-co-L-赖氨酸] 胆固醇聚乙烯亚胺基因载体

小粒径FeO-DMSA-PEI磁性纳米颗粒的制备及其基因负载能力研究

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无机材料学报 2024年

作者：蔡和庆韩璐杨松松薛新玉张扣孙志成刘儒平胡堃危岩清华大学生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室北京印刷学院印刷与包装工程学院

四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米颗粒因其制备简单、在外加磁场作用下的靶向性、表面易接枝等特性，可作为被动靶向载体应用于基因治疗领域。本研究采用溶剂热法并调控纳米颗粒的堆积生长时间，制得粒径在4～8 nm范围内可控的油相Fe3O4纳米... 详细信息

四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米颗粒因其制备简单、在外加磁场作用下的靶向性、表面易接枝等特性，可作为被动靶向载体应用于基因治疗领域。本研究采用溶剂热法并调控纳米颗粒的堆积生长时间，制得粒径在4～8 nm范围内可控的油相Fe3O4纳米颗粒；使用内消旋-2，3-二巯基丁二酸(DMSA)二次交换其表面的油酸分子，使其具备良好的水相分散性；通过酰胺化反应在其表面接枝支链型聚乙烯亚胺(PEI)，最终得到Fe3O4-DMSA-PEI磁性纳米颗粒。研究发现，Fe3O4-DMSA-PEI磁性纳米颗粒的表面Zeta电位高达(52.5±1.94) mV，仍具有一定的超顺磁性(14.48 emu/g，1 emu/g=1 A·m2/kg)，当该磁性纳米颗粒与质粒DNA的质量比为15: 1时，可完全阻滞DNA在凝胶上的电泳，装载量高达6.67%，表明本研究所制备的Fe3O4-DMSA-PEI磁性纳米颗粒具有一定的基因负载能力，有望作为基因载体应用于基因转染。

关键词：四氧化三铁磁性纳米颗粒基因载体表面改性

超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒的制备及其作为基因载体的可行性研究

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癌症 2004年第10期23卷 1105-1109页

作者：曹正国周四维孙凯鲁雄兵罗刚刘继红华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科湖北武汉430030

背景与目的:磁性纳米颗粒作为基因载体在肿瘤基因治疗中的应用得到了迅速发展。为了能获得驱动目的基因高效稳定表达、安全无害、靶向性高、简便的新型非病毒型基因导入和治疗系统,本研究探讨超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒(superparamag... 详细信息

背景与目的:磁性纳米颗粒作为基因载体在肿瘤基因治疗中的应用得到了迅速发展。为了能获得驱动目的基因高效稳定表达、安全无害、靶向性高、简便的新型非病毒型基因导入和治疗系统,本研究探讨超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒(superparamagneticdextranironoxidenanoparticles,SDION)的制备及其作为体外基因载体的可行性。方法:采用化学共沉淀法制作SDION,通过丙烯葡聚糖凝胶S-300HR色谱和离心法分离SDION,用透射电镜、粒度分析仪和磁力计对SDION进行分析。以绿色荧光蛋白(GFP-C2)质粒为靶基因,通过氧化还原法构建SDION-GFP-C2复合物,用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测两者的结合率。以脂质体转染作为对照,荧光显微镜分别观察SDION和脂质体体外转染GFP-C2入膀胱癌细胞BIU-87的转染效率。结果:SDION直径在3～8nm之间,有效粒径为59.2nm,比饱和磁化强度为0.23emu/g。分别经10mmol/L的高碘酸钠氧化、0.5mol/L的硼氢化钠还原作用后的SDION和GFP的结合比例最大,SDION对GFPDNA的转染效率为45%左右,明显高于脂质体的转染效率(30%左右)。结论:SDION可通过氧化还原反应与GFP质粒相连,在体外可将GFP基因成功转染入人膀胱癌BIU-87细胞。

关键词：基因载体转染效率体外脂质体质粒治疗系统肿瘤基因治疗 GFP基因目的基因超顺磁性