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变形链球菌LuxS调控功能的甲基代谢机制研究

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中华口腔医学杂志 2014年第9期49卷 530-534页

作者：王玉霞高丽江文欣朱彩莲何智妍黄正蔚上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学院牙体牙髓病科上海市口腔医学研究所上海市口腔医学重点实验室 200011

目的研究甲基代谢通路在变形链球菌LuxS相关调控功能中的作用,为探讨变形链球菌LuxS调控机制及临床生物膜防龋策略的制定提供依据.方法以构建的变形链球菌代谢SmUA159野生株（WT）及LuxS缺陷株（KO）、甲基代谢恢复株（KO-S）、空质... 详细信息

目的研究甲基代谢通路在变形链球菌LuxS相关调控功能中的作用,为探讨变形链球菌LuxS调控机制及临床生物膜防龋策略的制定提供依据.方法以构建的变形链球菌代谢SmUA159野生株（WT）及LuxS缺陷株（KO）、甲基代谢恢复株（KO-S）、空质粒对照株（KO-P）为研究模型,实时PCR观察生物膜及耐酸相关基因转录水平;甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法和共聚焦显微镜分别观察生物膜数量和结构;以不同pH环境下变形链球菌生物膜量的变化为指标,观察不同生物膜状态下各菌株的耐酸能力.结果实时PCR结果发现,4种被检测基因smu.44、smu.46、smu.238及gtfD在野生株WT的表达水平分别为1.289±0.051、1.694±0.140、1.565±0.107及1.667±0.196,在缺陷株KO中的表达水平分别为1.001±0.045、1.007±0.151、1.000±0.021及1.012±0.196,4种基因在KO中的表达均显著下调（P＜0.05）;4种基因在KO-S中的表达水平分别为4.662±0.091、5.019±0.258、3.462± 0.029及3.071 ±0.136,均显著高于KO及WT中的表达水平（P＜0.05）.4种菌株形成的生物膜数量（A值）分别为WT：1.592±0.213、KO：0.939±0.029、KO-S：2.177±0.226、KO-P：1.020±0.093,KO及KO-P的生物膜数量均显著小于WT （P＜0.05）,KO-S的生物膜数量显著高于其他3种菌株（P＜0.05）.WT生物膜结构均匀致密,KO、KO-S的生物膜可见大量较大团块及宽而长的沟裂,KO-S生物膜中大团块消失,代之以致密小颗粒,沟裂数量变少且较窄而短.耐酸实验显示,pH=4.3时KO及KO-P的生物膜减少量大于WT及KO-S.结论与野生株相比,变形链球菌LuxS缺陷株生物膜形成及耐酸能力在基因及生理水平均存在异常;甲基代谢循环恢复后,被检测基因变化恢复,生物膜数量完全恢复,生物结构部分恢复,耐酸能力得到恢复;甲基代谢循环通路在LuxS对变形链球菌生物膜及耐酸能力的调控中发挥重要作用.

关键词：链球菌,变异生物膜基因表达调控,细菌甲基代谢循环

甲型副伤寒杆菌pagC基因分布及其重组表达产物免疫保护作用

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浙江大学学报（医学版） 2013年第2期42卷 171-176,231页

作者：张佳范欣丽葛玉梅严杰孙爱华温州医学院检验医学院和生命科学学院浙江温州325035 浙江医学高等专科学校浙江杭州310053 浙江大学医学院病原生物学系浙江杭州310058

目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲... 详细信息

目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯表达的rPagC。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测rPagC表达情况及其产量。采用免疫扩散法、ELISA和Western Blot鉴定其抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rPagC对甲型副伤寒杆菌感染的免疫保护效果,微量肥达试验检测rPagC免疫小鼠血清凝集伤寒和副伤寒沙门菌的效果。结果:所有被检测的甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带pagC基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.1%～100%和98.4%～100%。所构建的原核表达系统能高效表达rPagC。rPagC免疫家兔可产生高效价抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号。ELISA结果显示,97.1%(66/68)甲型副伤寒患者血清标本rPagC抗体阳性。100μg和200μg rPagC对感染小鼠的免疫保护率分别为73.3%(11/15)和86.7%(13/15)。rPagC免疫小鼠血清对甲型副伤寒沙门菌和伤寒沙门菌H抗原凝集效价高达1∶10～1∶40。结论:pagC基因在甲型副伤寒沙门菌株中分布广泛。rPagC有良好的免疫原性及较强的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原。

关键词：沙门菌,甲型副伤寒免疫学沙门菌,甲型副伤寒遗传学基因表达调控,细菌重组,遗传基因表达 pagC基因重组表达免疫原性免疫保护性

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

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浙江大学学报（医学版） 2009年第3期38卷 276-282页

作者：樊欢孙爱华夏肖萍孙琦严杰浙江大学医学院病原生物学系浙江杭州310058 浙江医学高等专科学校浙江杭州310053 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科浙江杭州310016

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS... 详细信息

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌*** BL21DE3pET42a-comD、***21DE3pET42a-comE和*** BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。

关键词：链球菌,肺炎/遗传学聚合酶链反应信号传导 β内酰胺酶类抗药性,细菌基因表达重组蛋白质类基因表达调控,细菌

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整合子在细菌耐药性研究中的新进展

中华检验医学杂志 2017年第1期40卷 7-10页

作者：顾兵姜飞徐州医科大学附属医院检验科 221002

整合子是一个新的细菌耐药基因水平传播元件，近年来学者们对其介导的病原菌耐药机制进行了大量研究。本文在阐述整合子介导细菌多重耐药机制的基础上，总结其在肠杆菌科细菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等细菌中的检出情况及新发现整... 详细信息

整合子是一个新的细菌耐药基因水平传播元件，近年来学者们对其介导的病原菌耐药机制进行了大量研究。本文在阐述整合子介导细菌多重耐药机制的基础上，总结其在肠杆菌科细菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等细菌中的检出情况及新发现整合子基因盒类型，并展望未来研究方向。

关键词：抗药性,多种,细菌整合子类基因表达调控,细菌肠杆菌科

miR-20a-5p调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡相关基因表达的研究

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中国防痨杂志 2019年第7期41卷 747-753页

作者：丁光贵贺星梁娟刘亚亚欧敏陆坚张国良深圳市人民医院胸外科 518020 深圳市第三人民医院新发传染病诊治重点实验室暨南大学深圳大学总医院感染科

目的明确小非编码RNA(microRNA,miR-20a-5p)对结核分枝杆菌(MTB)诱导人巨噬细胞凋亡相关基因表达的调控作用。方法构建可表达或抑制miR-20a-5p、转染miR-20a-5p抑制剂(miR-20a-5p-inhibitor,简称“miR-20a-5p-inh”)、作为慢病毒载体的阴性对照(LV1-NC)的慢病毒载体,由oligo-dT引物通过固相亚磷酰胺法合成茎环寡核苷酸,并克隆到含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pGLV3-GFP内,将构建的miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh、LV1-NC转染THP-1人巨噬细胞3h,培养72h后用流式细胞仪分选出GFP+THP-1细胞,并分别采用减毒MTB菌株(H37Ra)感染8h和过氧化氢(H2O2)处理30min 两种方法诱导。通过实时定量PCR技术测定细胞中线粒体相关抗凋亡基因Bcl-2,以及促凋亡基因Bax、Bim和Bad的转录水平。同时,用蛋白免疫印迹法检测细胞裂解物中相关蛋白的表达。结果慢病毒转染细胞后,在无刺激的THP-1细胞中miR-20a-5p的相对荧光强度值为12.21±1.29、miR-20a-5p-inh为9.68±1.38、LV1-NC为10.64±0.96,三者的表达差异均无统计学意义(q=1.815,P=0.385;q=2.072,P=0.602);但在H37Ra和H2O2的刺激后,miR-20a-5p过表达时其相对荧光强度值分别为7.20±0.53、8.55±0.82,明显高于LV1-NC (4.46±0.07、5.49±0.44)(q=50.250,P=0.007;q=1.041,P表达增加(相对荧光强度值由10.67±0.89增至14.98±0.88)(q=1.064,P=0.008),而感染miR-20a-5p-inh慢病毒时Bcl-2表达减少(由10.67±0.89降至6.49±0.47)(q=3.518,P=0.003);在miR-20a-5p过表达的THP-1细胞中Bim的转录水平减少(由1.22±0.05降至0.98±0.04)(q=1.240,P=0.011),当miR-20a-5p受抑制时Bim的转录水平增加(由1.22±0.05增至1.51±0.08)(q=2.460,P=0.021)。蛋白印迹法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bim的蛋白表达水平,结果与基因转录水平相符。结论 miR-20a-5p的表达水平影响MTB诱导的巨噬细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bim的表达,并且与促凋亡基因Bim的水平呈负相关,提示miR-20a-5p可能通过调控Bim的表达而影响细胞凋亡。

关键词：分枝杆菌,结核 RNA,小,非转录细胞凋亡基因,bcl-2 基因表达调控,细菌巨噬细胞

16S rRNA基因文库方法在感染标本菌群分析中的应用

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解放军医药杂志 2013年第1期25卷 57-59页

作者：常玉梅刘海燕解放军252医院中心实验室河北保定071000

目的探讨16S rRNA基因文库方法对感染标本菌群的鉴定效果。方法采集70例创伤患者的感染伤口脓液或渗出液标本,使用通用引物扩增标本中所有细菌的16S rRNA基因片段,构建16S rRNA基因文库,挑取阳性克隆测序,分析感染细菌的数量与种类。结... 详细信息

目的探讨16S rRNA基因文库方法对感染标本菌群的鉴定效果。方法采集70例创伤患者的感染伤口脓液或渗出液标本,使用通用引物扩增标本中所有细菌的16S rRNA基因片段,构建16S rRNA基因文库,挑取阳性克隆测序,分析感染细菌的数量与种类。结果从150个克隆子中检测7种不同酶切类型的克隆,鉴定出7类微生物,其中屎肠球菌种类最多,占88%,坚强肠球菌比例占2%,另5类序列与非可培养细菌类群的16S rRNA基因序列相似性较高,均占2%。结论感染标本中屎肠球菌含量丰富,应用16S rRNA基因文库的方法可有效分离到感染标本中的非可培养菌。

关键词：创伤和损伤感染基因表达调控,细菌基因克隆文库方法

lasI rhlI基因缺陷对铜绿假单胞菌生物膜形成影响的体外实验研究

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中国医药生物技术 2007年第3期2卷 194-196页

作者：刘晓岚宋志军吴红刘海静王立赞陈一强孔晋亮王恒壮陈海荣济宁医学院病理生理学教研室 272013 广西医科大学病理生理学教研室丹麦国家医院临床微生物科广西医科大学第一附属医院呼吸内科

目的研究群体感应系统在铜绿假单胞菌(PA)生物膜形成中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行群体感应系统完整的PAO1野生型菌株与群体感应系统缺陷(lasI rhlI基因缺陷)型菌株的体外培养,分别于培养第3、7天用扫描电镜观察两种类型P... 详细信息

目的研究群体感应系统在铜绿假单胞菌(PA)生物膜形成中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行群体感应系统完整的PAO1野生型菌株与群体感应系统缺陷(lasI rhlI基因缺陷)型菌株的体外培养,分别于培养第3、7天用扫描电镜观察两种类型PAO1的生物膜形成情况。结果培养第3天PAO1野生型菌株可形成较厚、有孔状通道的成熟生物膜结构,而lasI rhlI基因缺陷型菌株仅形成明显稀薄的早期生物膜结构;培养第7天PAO1野生型菌株的生物膜增厚,lasI rhlI基因缺陷型菌株所形成的生物膜结构呈薄膜状,显著薄于野生型菌株。结论lasI rhlI基因缺陷明显影响PA的生物膜形成能力,群体感应系统在PA生物膜形成中发挥重要作用。

关键词：生物膜假单胞菌,铜绿基因表达调控,细菌

铜绿假单胞菌群体感应lasI/rhlI基因对其生物被膜形成的影响

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国际检验医学杂志 2013年第14期34卷 1779-1781页

作者：胡昌俊李德辉朱艮苗重庆开县人民医院检验科 405400

目的分析铜绿假单胞菌群体感应系统lasI/rhlI基因对生物被膜形成的影响,探讨群体感应系统对生物被膜形成的调控机制。方法采用结晶紫染色法分析铜绿假单胞菌标准株PAO1及其群体感应系统lasI/rhlI基因缺陷株PA210(△rh-lI)、PA214(△lasI... 详细信息

目的分析铜绿假单胞菌群体感应系统lasI/rhlI基因对生物被膜形成的影响,探讨群体感应系统对生物被膜形成的调控机制。方法采用结晶紫染色法分析铜绿假单胞菌标准株PAO1及其群体感应系统lasI/rhlI基因缺陷株PA210(△rh-lI)、PA214(△lasI)及PA216(△lasI/rhlI)生物被膜的形成能力。结果铜绿假单胞菌标准株PAO1能形成成熟的生物被膜,基因缺陷株PA214(△lasI)可形成较薄的生物被膜,而PA210(△rhlI)及PA216(△lasI/rhlI)则不能形成生物被膜。结论 lasI/rhlI基因缺陷可影响铜绿假单胞菌生物被膜形成,但rhlI基因对生物被膜形成的影响更为显著。

关键词：假单胞菌,铜绿生物膜基因表达调控,细菌

大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响

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中国医药生物技术 2008年第2期3卷 93-97页

作者：王静于金龙张婷郭长江徐琪寿黄英武河南中医学院基础医学院郑州450008 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850 军事医学科学院卫生学与环境医学研究所天津300050 解放军第三〇六医院实验病理科北京100101

目的改造大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,以进一步提高色氨酸产量。方法根据ppsA和tktA基因序列分别合成引物行PCR扩增,将PCR扩增所得PLacO1-tktA-T1片段和pZA31质粒连接,经筛选鉴定正确的pZA31-tktA重组质粒和PCR扩增所得PLacO1... 详细信息

目的改造大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,以进一步提高色氨酸产量。方法根据ppsA和tktA基因序列分别合成引物行PCR扩增,将PCR扩增所得PLacO1-tktA-T1片段和pZA31质粒连接,经筛选鉴定正确的pZA31-tktA重组质粒和PCR扩增所得PLacO1-ppsA-T1片段连接,构建pZA31-ppsA-tktA重组质粒,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒共转化至***1655ΔRT-R,获得的重组菌株命名为***1655ΔRT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr](工程菌);以pZE12-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒转化至***1655ΔRT-R得到的重组菌株***1655ΔRT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作为对照菌株,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,3h后收集部分菌体行ppsA、tktA酶活性测定,其余发酵液继续培养4～5h后,监测调整培养基中葡萄糖浓度和pH值保持不变,48h后检测色氨酸产量。结果PCR扩增所得片段均与预期DNA表达片段大小一致;pZA31-ppsA-tktA重组质粒测序显示,克隆的tktA和ppsA基因序列与报告序列完全相同。工程菌ppsA和tktA酶活性(U)与对照菌株比较,分别提高了3和3.5倍(分别为0.25±0.04vs.0.08±0.02,P基因工程菌打下了基础。

关键词：色氨酸生物合成途径大肠杆菌基因表达调控,细菌