检索结果-南通市图书馆

作者：叶蕾江西农业大学

学位级别：硕士

水稻（Oryza sativa）是我国重要的粮食作物,保证其播种面积的稳定、产量的平稳增长,进一步提高其质量和安全性,对于增加农民收入、持续巩固脱贫攻坚成果、确保国家粮食安全、加快农业农村现代化建设有着重要意义。植物病害是实现粮食... 详细信息

水稻（Oryza sativa）是我国重要的粮食作物,保证其播种面积的稳定、产量的平稳增长,进一步提高其质量和安全性,对于增加农民收入、持续巩固脱贫攻坚成果、确保国家粮食安全、加快农业农村现代化建设有着重要意义。植物病害是实现粮食安全和食品安全的主要限制因素之一。在各种植物病原体中,植物线虫会导致粮食作物产量下降约5-20%。木质素在水稻的机械支撑、水分传导、抵挡病虫害方面可能发挥着重要的作用。大量研究表明,植株在受到外界生物或非生物侵害时,会诱导木质素的含量增加,促进植物细胞壁木质化,形成机械屏障。咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-Coenzyme A 3-O-Methyltransferase,CCoAOMT）是木质素生物合成中重要的甲基酶。已从许多植物中克隆出编码该蛋白的基因,CCoAOMT含量的高低,会影响木质素组成和含量的变化。CCoAOMT参与植株的胁迫反应,在植株抵御外界侵害方面发挥作用。实验室前期得到抗潜根线虫水稻转录组数据,从中挑选了一个上调基因—CCoAOMT,进一步研究该基因互作机制与功能。从水稻根部克隆该基因,命名为Os COA（登录号:MW812350）。利用生物信息学对该基因进行初步的结构和保守域分析,确定其属于CCoAOMT家族。构建了水稻Os COA原核表达载体,进行Os COA重组蛋白表达,发现在18°C以终浓度为0.1 m M的IPTG诱导8 h的条件下可在体外诱导大量Os COA蛋白可溶性表达,为继续寻找与其互作蛋白、分析Os COA基因在抗线虫方面的功能做铺垫。构建过表达载体和干扰载体,并获得相应的转基因植株。利用q RT-PCR技术分析得Os COA基因的表达量在过表达转基因水稻中极显著增加,且在不同组织中存在表达量差异,在根中表达量最高,茎其次。为了探究转过表达基因水稻的抗线虫机理,在潜根线虫侵染抗性品种一周后,分析Os COA基因的表达情况。结果发现过表达水稻根部该基因表达量急剧增长,极显著高于其他组织,且潜根线虫在过表达植株中的侵染量下降约18%,推测Os COA在防治潜根线虫病害中发挥重要作用,有望为潜根线虫的防治以及抗性机理深入研究提供重要依据。

关键词：水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶抗潜根线虫基因基因表达与纯化

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四种转基因植物胶体金标记快速检测试剂盒的研制

四种转基因植物胶体金标记快速检测试剂盒的研制

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作者：余素红福建农林大学

学位级别：硕士

转基因植物研究及其产业化的飞速发展对其检测方法提出了更高的要求。目前常用的检测方法主要分为三类：生物测定(实验室及田间检测)、DNA水平检测(PCR、Southern blotting等)和蛋白质水平检测(ELISA、Western blotting)。但这些常规方... 详细信息

转基因植物研究及其产业化的飞速发展对其检测方法提出了更高的要求。目前常用的检测方法主要分为三类：生物测定(实验室及田间检测)、DNA水平检测(PCR、Southern blotting等)和蛋白质水平检测(ELISA、Western blotting)。但这些常规方法耗时、耗力，工作量大，不适于转基因植物的快速检测。因此，建立转基因植物快速、方便、有效的检测方法十分必要。本研究运用胶体金标记免疫检测技术，初步建立了抗虫基因CryIA(e)、SCH(Signal-CryllBal-HDEL)、CpTI和标记基因Hpt等四种转基因植物胶体金标记快速检测试剂盒。主要工作结果如下： 1、将重组质粒pGEX-4T-3-Hpt在***中高效表达，利用亲和层析的方法对表达的GST-HPT融合蛋白进行纯化，并进一步获得HPT蛋白。以纯化的HPT蛋白免疫新西兰大白兔，得到相应的多克隆抗体，经间接ELISA法检测，抗体能与HPT蛋白特异性结合，其相关系数达到极显著水平，满足转基因植物的ELISA和金标试剂盒的检测要求。 2、应用饱和硫酸铵法纯化待标记的四种抗体，CryIA(e)抗体浓度为8643.42μg／ml，SCH抗体浓度为9575.82μg／ml，CpTI抗体浓度为9485.01μg／ml，HPT抗体浓度为9732.16μg／ml。采用间接法测纯化后抗体的效价，CryIA(e)抗体效价＞1：10，000，SCH抗体效价＞1：8000，CpTI抗体效价＞1：7，000，HPT抗体效价＞1：16，000。 3、采用柠檬酸三钠还原法制得直径约15nm的胶体金。经电镜拍摄显示该胶体金颗粒大小均匀一致，基本相同，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，且呈清亮透明的酒红色，放置半年后仍十分稳定，未见沉淀及变色现象。经检测得每毫升胶体金中标记抗体的稳定量分别如下：CryIA(e)抗体为60μg，SCH抗体为48μg，CpTI抗体为66μg，Hpt福建农林人学硕卜学位论文:四种转摧因植物胶体金标记快速检测试剂盒的研制打L体为60件g。研制出转快速检测试纸盒。份yIA介夕、SCll、印Tl 111 Ilnt基因植物胶体金标一记试剂盒的检测结果确定时间为:强阳性样品在5分钊，内即可在检测线看到红色胶体金聚集体，弱阳性样品则需半小时左右方可确定。检测结果以测试条硝酸纤维素膜上出现两条红色条带(检测线和质控线)为阳性，出现一条红色条带(质控线)为阴性，若没有红色条带出现，则试剂盒失效。 5、以ELISA检测结果为标准，将试剂盒检测结果与ELISA结果进行对照，得出金标试剂盒检测价丁IA(e)的灵敏度为96.0%，特异性为100%，符合率为96.1%;检测SCH的灵敏度为90.1%，特异性为91%，符合率为90%:检测即7’I的灵敏度为92.4%，特异性为97%，符合率为94%;HPt标记的转基因植物的检测工作目前还在进行中。经HPt纯蛋白检测其特异性良好。 6、研制的金标试剂盒的热稳定性实验表明，试剂盒于低温密封干燥处贮存可保质半年。我们研制的转基因植物胶体金标一记快速检测系统与常规的检测方法相比，具有单份操作、简单、快速、无污染等优点。国内目前还未见文献报道运用胶体金标记技术检测转基因植物。关于转基因植物胶体金标一记快速检测系统的相关专利己在申请中。

关键词：基因表达与纯化金标试剂盒 ELISA 转基因植物

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HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性分析

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激光生物学报 2008年第2期17卷 235-238页

作者：张如新聂东宋邵阳学院生物与化学工程系湖南邵阳422000 湖南理工学院化学化工系

目的:表达HCV核心蛋白,为检测丙肝病毒提供合适抗原。方法:以含HCV核心全长cDNA克隆的pMD18T/core质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因,插入表达载体pQEN1构建重组质粒pQEN1/Core,转化BL-21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His融合蛋... 详细信息

目的:表达HCV核心蛋白,为检测丙肝病毒提供合适抗原。方法:以含HCV核心全长cDNA克隆的pMD18T/core质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因,插入表达载体pQEN1构建重组质粒pQEN1/Core,转化BL-21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:经SDS-PAGE及Western blot显示HCV核心蛋白在大肠杆菌中正确表达,融合蛋白分子量约为22 kD,表达量约占菌体蛋白总量的30%。纯化后的C蛋白能与慢性丙型肝炎患者有血清反应。结论:HCV核心蛋白在大肠杆菌中成功表达并具有较强的抗原性。

关键词： HCV核心抗原基因表达与纯化血清学反应

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