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沙门菌噬菌体T139基因组分析及其裂解酶LysT40的异源表达和活性鉴定

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华中农业大学学报 2021年第6期40卷 176-185页

作者：丁一峰聂若男朱文娟王吉王佳王小红华中农业大学食品科学技术学院武汉430070

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基... 详细信息

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白(LysT40)包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构(70.63%),使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10~15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD600相比于对照组分别下降0.18和0.31。

关键词：鼠伤寒沙门菌基因组分析噬菌体裂解酶表达纯化裂解活性食源性致病菌抗菌药物替代品

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三维基因组分析点亮人类大脑进化之谜

遗传 2021年第2期43卷 105-107页

作者：罗鑫宿兵中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室昆明650223

人类大脑起源于漫长的生命进化过程,其最显著的改变是大脑的认知功能,反映在脑容量的显著扩增和脑结构的高度精细化[1]。人类进化过程中哪些遗传改变造就了人类大脑是国际科学界长期力图回答的重要科学问题。所有器官包括大脑的形成都... 详细信息

人类大脑起源于漫长的生命进化过程,其最显著的改变是大脑的认知功能,反映在脑容量的显著扩增和脑结构的高度精细化[1]。人类进化过程中哪些遗传改变造就了人类大脑是国际科学界长期力图回答的重要科学问题。所有器官包括大脑的形成都是通过发育过程来实现的,人类独特的脑发育模式源于在进化中基因组积累的功能性突变。通过近20年的比较基因组学研究已经发现大量人类特异的基因组序列变异和调控元件,典型的如人类快速进化区域(human accelerated regions,HARs)和人类特异的增强子(human-specific enhancers, HGEs)[2,3]。

关键词：人类大脑生命进化脑容量人类进化过程脑结构基因组分析脑发育比较基因组学

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几种生物的基因组分析

生命的化学 1998年第5期18卷 20-26页

作者：赵文会洪国藩中国科学院国家基因研究中心

几种生物的基因组分析赵文会洪国藩（中国科学院国家基因研究中心，上海２００２３３）关键词基因组分析Ｅ．ｃｏｌｉＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉ酵母基因组研究是当今世界生物学中投资最大的两大热点领域之一（另一个是艾滋病研究）。迄今... 详细信息

几种生物的基因组分析赵文会洪国藩（中国科学院国家基因研究中心，上海２００２３３）关键词基因组分析Ｅ．ｃｏｌｉＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉ酵母基因组研究是当今世界生物学中投资最大的两大热点领域之一（另一个是艾滋病研究）。迄今已完成多种生物的基因组测序（表１）...

关键词：基因组分析酵母 E.olis基因

一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体IME-CF2的分离、测序及全基因组分析

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安徽医科大学学报 2016年第3期51卷 315-319页

作者：刘小东王伟黄勇张湘莉兰孙强安小平米志强童贻刚安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的从医院污水中分离一株能裂解弗氏柠檬酸杆菌的噬菌体,观察其形态,并进行全基因组测序和全基因组分析,为治疗和控制弗氏柠檬酸杆菌感染提供基础。方法以弗氏柠檬酸杆菌为宿主,从医院污水分离噬菌体,用透射电镜观察其形态;使用Ion Tor... 详细信息

目的从医院污水中分离一株能裂解弗氏柠檬酸杆菌的噬菌体,观察其形态,并进行全基因组测序和全基因组分析,为治疗和控制弗氏柠檬酸杆菌感染提供基础。方法以弗氏柠檬酸杆菌为宿主,从医院污水分离噬菌体,用透射电镜观察其形态;使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后进行噬菌体全基因组序列组装、注释、进化分析和比较分析。结果成功分离一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体,命名为IME-CF2;电镜观察显示,该噬菌体具有二十面体的头部,形态类似肌尾噬菌体科;IME-CF2核酸类型为DNA,基因组全长为177 685 bp,GC含量为43.2%;编码267个编码区(CDS),2个tRNA;进化分析表明,IME-CF2属于T4类噬菌体,全基因组比较分析表明,IME-CF2与柠檬酸杆菌噬菌体Miller同源性最高。结论分离鉴定了一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体,进行了全基因组测序和分析,为噬菌体治疗多重耐药细菌奠定了基础。

关键词：弗氏柠檬酸杆菌噬菌体全基因组测序基因组分析

解磷菌A02的解磷活性、基因组分析及解磷基因的克隆与表达研究

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解磷菌A02的解磷活性、基因组分析及解磷基因的克隆与表达研究

作者：席欢南京大学

学位级别：硕士

磷是重要的生源要素,对植物的生长发育具有重要意义。虽然土壤中总磷含量巨大,但由于土壤中的磷主要以难溶性的磷酸盐形式存在,不能被植物直接吸收利用。因此,如何提高土壤中难溶性磷酸盐磷的可溶性转化,是目前土壤学领域的重要研究课... 详细信息

磷是重要的生源要素,对植物的生长发育具有重要意义。虽然土壤中总磷含量巨大,但由于土壤中的磷主要以难溶性的磷酸盐形式存在,不能被植物直接吸收利用。因此,如何提高土壤中难溶性磷酸盐磷的可溶性转化,是目前土壤学领域的重要研究课题之一。解磷微生物(Phosphate-Solubilizing Microorganism,PSM)是一类能将难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷的微生物,其中,研究较多的是解磷细菌(Phosphorus Solubilizing Bacteria,PSB),该类细菌具有生长速度快、解磷活性高、容易大规模发酵和遗传操作方便等优点备受关注。然而,由于解磷细菌的多样性及其解磷机理的复杂性,开展针对特定菌株的解磷机理研究仍十分必要。本文以一株从活性淤泥中分离获得的解磷细菌A02菌株为对象,针对其解磷活性及解磷机理,开展了如下研究:1)分类地位、解磷活性及解磷机理;2)基因组学分析;3)解磷基因的克隆及活性验证。基于形态学的显微观察、生理生化反应以及16S rDNA序列的同源性比较分析,将该菌株鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。采用磷钼蓝分光光度计法,研究了该菌在NBRIP培养基中的解磷过程及解磷效率,37℃、180 rpm培养4d可溶性磷浓度高达271.9 μg/ml。因此,A02菌株是一株高效解磷细菌。为了探究A02菌株的解磷效果和解磷机理是否与其能够产生磷酸酶及有机酸有关,我们检测了磷胁迫下酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性,发现碱性磷酸酶表达较早,在解磷的早期发挥作用,24 h后活性逐渐降低,而酸性磷酸酶的活性一直较高,为主要的解磷酶。另外,以Ca3PO4为唯一磷源,研究了该菌解磷过程中pH的变化规律,接种后48 h,培养液的pH由7降至4.8,可见pH降低是A02菌株的主要解磷机理。为了揭示A02菌株导致pH降低的原因,采用高效液相色谱(HPLC)技术,分析了该菌解磷过程中产生的有机酸种类,发现甲酸、乳酸和延胡索酸可能与该菌解磷过程中的pH降低有关。为了阐明A02菌株解磷的分子机理,我们对该菌株进行了全基因组测序和生物信息学分析。结果显示,该菌的基因组大小4,608,301 bp,平均GC含量为55%,4450基因(4326 CDS和93 RNA);且与阴沟肠杆菌ECNIH4的覆盖度最大为92%,序列相似度99%。基因组岛(Genome Islands)预测发现该菌株有一个GI集中区,其中,编码耐药系统、抗菌多肽转移系统和金属耐受蛋白可能与A02菌株对环境毒力因子的抗性以及环境适应性有关。次级代谢基因簇预测发现该菌含有18个基因簇,簇10和簇17的GC含量明显偏离于平均GC含量,且在肠杆菌中分布较少。簇10主要编码合成酶、脱氢酶、裂解酶等,而簇17主要编码转移酶、磷酸酶和转录调控因子等,显示该菌株可能具有基因水平迁移的能力。基于文献调研和基因组序列分析,在A02菌株基因组中共发现2个与解磷活性有关的基因gcd和hisQ。为了证明这两个基因参与了 A02菌株的解磷活性,我们采用基因克隆并转入大肠杆菌DH5α表达的方法来验证了这两个基因的功能。结果表明,gcd和hisQ不仅能够在大肠杆菌中表达,而且导致培养液pH下降、可溶性磷酸盐含量升高、解磷活性增加,说明该基因参与调节阴沟肠杆菌A02菌株的解磷活性。综上所述,阴沟肠杆菌A02是一株高效解磷细菌,具有重要的应用价值。

关键词：生理生化 16S rDNA 难溶性磷酸盐解磷机理有机酸磷酸酶基因组分析同源重组

沙雷氏菌(Serratia sp.) AXJ-M响应高温胁迫的生理适应性

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微生物学通报 2024年

作者：汪流伟王燕林惠淑雨冯齐齐程宓丽菡冯瑞罗文怡李亚婷陈瑶瑶安雪姣江西农业大学生物科学与工程学院

【背景】利用微生物法治理造纸废水或被其污染的环境具有重要的现实意义，但是关于微生物在造纸废水高温环境胁迫下的生理补偿适应机制尚缺乏探讨。【目的】以实验室保藏的1株嗜热木质素降解菌Serratia sp. AXJ-M为对象，开展其对热胁... 详细信息

【背景】利用微生物法治理造纸废水或被其污染的环境具有重要的现实意义，但是关于微生物在造纸废水高温环境胁迫下的生理补偿适应机制尚缺乏探讨。【目的】以实验室保藏的1株嗜热木质素降解菌Serratia sp. AXJ-M为对象，开展其对热胁迫的生理响应机制研究。【方法】设计温度胁迫培养实验，采集不同温度下的菌体，测定菌体形态、细胞膜流动性与渗透性、细胞海藻糖含量及抗氧化酶系统相关酶的活性变化。基于Illumina HiSeq 2000平台对AXJ-M进行de novo测序分析，用GO、COG、KEGG、NR以及Swiss-Prot数据库进行基因组基本功能注释。【结果】热胁迫实验表明，菌株AXJ-M能够在50-80 ℃的热胁迫环境中生存，其中50 ℃是最适生长温度，在高于70 ℃的热胁迫环境下其生长会被明显抑制。与最适温度(50 ℃)相比，菌株AXJ-M经热胁迫培养后，其个体形态有明显差异，表面粗糙程度增加。相比于最适生长温度，菌株AXJ-M在高温胁迫(80 ℃)下细胞膜流动性降低，膜通透性提高，海藻糖含量提高。高温胁迫(80 ℃)下与氧化应激有关的一些酶活性显著增加，过氧化氢酶(catalase， CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)和过氧化物酶(peroxidase， POD)活性随着培养时间的延长分别提高50%-80%、30%-47%、24%-31%。通过将基因组测序结果与数据库比对并检索，菌株AXJ-M含有参与响应热胁迫的相关基因。【结论】热胁迫培养可诱导菌株AXJ-M产生耐热性并使菌体个体形态发生改变，海藻糖含量和抗氧化酶系统活性的升高保护细胞抵抗外界不良环境。菌株全基因组的初步解析，对研究嗜热菌在高温环境中的分子反应机制奠定了基础。

关键词：嗜热木质素降解菌热胁迫生理响应基因组分析

Delftia tsuruhatensis MTQ3基因组分析及铁载体合成相关基因的功能鉴定

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Delftia tsuruhatensis MTQ3基因组分析及铁载体合成相关基因的功...

作者：郭海萌山东农业大学

学位级别：硕士

Delftia tsuruhatensis MTQ3是一株分离自烟草根际土壤的对青枯病病原菌具有拮抗作用的植物根际促生细菌。本研究对MTQ3菌株进行基因组测序分析,采用基因敲除技术鉴定功能基因,探索该菌株的拮抗分子机制,其中重点对铁载体合成相关基因(N... 详细信息

Delftia tsuruhatensis MTQ3是一株分离自烟草根际土壤的对青枯病病原菌具有拮抗作用的植物根际促生细菌。本研究对MTQ3菌株进行基因组测序分析,采用基因敲除技术鉴定功能基因,探索该菌株的拮抗分子机制,其中重点对铁载体合成相关基因(NRPS)的功能进行了研究。基于Illumina HiSeq 2500测序平台,利用鸟枪法对MTQ3进行基因组测序。通过对原始数据的过滤以及拼接等处理,最终得到MTQ3基因组相关信息:基因组大小为6.27Mb,包括136个contigs,12个scaffolds,GC含量为66.79%;总基因数目为5101个,其中包括5005个CDS,13个pseudogenes,72个tRNA,1个ncRNA以及10个rRNA。根据MTQ3基因组测序结果功能注释,发现许多与抗菌物质(如细菌素、聚酮化合物、NRPs等)合成相关的基因。除此之外,MTQ3还有许多与环境适应性相关的基因:如与生物膜形成相关的基因;与固氮作用相关的基因;与芳香酸的降解有关的原儿茶酸基因;与苯乙酸和除草剂的降解相关的基因等。根据16S rRNA序列对Delftia tsuruhatensis MTQ3进行系统发育分析,发现MTQ3与Delftia tsuruhatensis亲缘关系较近。对MTQ3、Delftia tsuruhatensis 391、D.Acidovorans SPH-1以及Delftia sp.Cs1-4进行比较基因组分析。对于四个基因组一般特征的比较发现:菌株SPH-1的基因组最大,编码基因(CDS)的数目最多;MTQ3基因组最小,编码基因的个数最少的为菌株391。四个菌株的GC含量的平均值为66.57%,并且不同菌株的GC含量偏离平均值的量均小于0.3%,这在一定程度上表明了物种之间的亲缘关系。经比较发现MTQ3、Cs1-4、SPH-1以及菌株391共有2540个同源基因;MTQ3与Cs1-4、SPH-1、菌株391同源的基因数目分别为4470、4414、2782;此外,与其他三个菌株相比,MTQ3特有的基因数目比较少,仅有265个。通过对四个基因组基因的COG功能聚类分析发现,MTQ3、Cs1-4、菌株391以及SPH-1四株代尔夫特菌的基因在分布倾向上有相似之处。在四个基因组中,参与转录、氨基酸转运和代谢、脂质转运和代谢的基因较多,代表了相对丰富的功能类别。与Cs1-4、SPH-1以及菌株391的基因组相比,MTQ3基因组中具有的代表碳水化合物转运和代谢的基因数目较多。对Delftia基因组的NRPS基因簇进行比较分析,发现MTQ3中的NRPS基因簇与Cs1-4和SPH-1的相似度分别为71%和65%,说明并非所有的Delftia都有完全相同的NRPS基因簇,这有可能与它们在各自特定环境中的适应性有关。为了深入了解拮抗机制,利用基因敲除的方法对一些基因的功能进行研究。通过基因敲除得到突变株MTQ3-Δ1941、MTQ3-Δ1945、MTQ3-Δ1946、MTQ3-Δ00865、MTQ3-Δ02705、MTQ3-Δ11480、MTQ3-Δ12420。对突变株的拮抗功能进行验证,发现突变株对青枯病病原菌的拮抗活性并未消失,说明以上基因的功能与拮抗性能无关或关系不大。通过对MTQ3及NRPS突变株MTQ3-Δ1941、MTQ3-Δ1945、MTQ3-Δ1946产铁载体能力的定性定量检测发现NRPS突变株失去产铁载体能力,说明MTQ3中NRPS基因的功能与铁载体的合成有关。对MTQ3产生的铁载体类型进行检测发现,MTQ3产生是羧酸型铁载体。本研究以首次从烟草根际分离的PGPR菌株MTQ3为研究对象,利用基因组学的方法,旨在从分子水平上探索拮抗的相关机制。由于基因组信息的复杂性,在MTQ3基因组中发现大量与抗菌物质合成相关的基因,这就为拮抗物质的发掘带来一定困难。但是基因组注释信息的完成又为研究某些特定基因的功能提供分子生物学水平的依据,为进一步的研究工作奠定了基础,因此具有重要的意义。

关键词：代尔夫特菌基因组分析铁载体 NRPS

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产气肠杆菌噬菌体生物学特性与基因组分析

产气肠杆菌噬菌体生物学特性与基因组分析

作者：马艳艳河南科技学院

学位级别：硕士

产气肠杆菌是一种重要的条件致病菌,可引起肺炎、菌血症、泌尿系统感染等,本研究以一株多重耐药产气肠杆菌为宿主,从污水中分离出一株噬菌体,并对该噬菌体的生物学特性和基因组进行分析,以期找到一种抗生素替代方案,为之后的噬菌体治疗... 详细信息

产气肠杆菌是一种重要的条件致病菌,可引起肺炎、菌血症、泌尿系统感染等,本研究以一株多重耐药产气肠杆菌为宿主,从污水中分离出一株噬菌体,并对该噬菌体的生物学特性和基因组进行分析,以期找到一种抗生素替代方案,为之后的噬菌体治疗做铺垫。主要内容与结果如下:1.产气肠杆菌噬菌体的分离从医院获得一株多重耐药产气肠杆菌3-SP,通过菌种鉴定,耐药性分析等,确定菌种信息,并将其保存于菌库。然后以该菌为宿主,以环境污水为样品,分离出一株烈性噬菌体,命名为phiEap-2,并制备好噬菌体原种悬浮液,保存于本实验室。2.产气肠杆菌噬菌体生物学特性研究在透射电镜下观察发现,phiEap-2为蝌蚪状,蛋白质衣壳的头部直径约55 nm,非收缩尾部长度约为117 nm,直径10 nm,可判断该噬菌体属于长尾噬菌体科。一步生长曲线的绘制表明,噬菌体phiEap-2的潜伏期为20min,爆发期约40min。稳定性研究表明,噬菌体phiEap-2对温度较为敏感,在高温(70-80℃)处理下会失去活性,而在人体体温(37℃)、室温(24℃)和低温(4℃)下,会保持较高的活性;噬菌体phiEap-2在pH基因组分析经过提取与纯化,得到纯度较高的的噬菌体phiEap-2基因组,对其进行测序,并将其基因组全序列及注释信息上传至Genbank,序列号为KT287080。phiEap-2基因组长度为40491bp,GC含量为51.95%,属于线状双链DNA。对噬菌体的基因组进行预测之后,得到62个开放阅读框,其中23个开放阅读框的功能可以被注释,39个开放阅读框被注释为假定蛋白。分析表明,phiEap-2结构基因模块与噬菌体FSL SP-031和粘质沙雷氏菌噬菌体ETA有一定程度的序列保守性,虽然噬菌体之间存在着显著差异,但是结构基因模块是在这三株噬菌体(phiEap-2,FSL SP-031和ETA)基因组相同位置发现的,这表明phi Eap-2与沙门氏菌噬菌体FSL SP-031和粘质沙雷氏菌噬菌体ETA在进化上是相关的。

关键词：噬菌体产气肠杆菌生物学特性基因组分析

猪链球菌CZ130302糖基水解酶CZGH25功能研究及WH1609基因组分析

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猪链球菌CZ130302糖基水解酶CZGH25功能研究及WH1609基因组分析

作者：陈申申南京农业大学

学位级别：硕士

猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人畜共患病病原,感染猪或人后可引起脑膜炎、败血症、关节炎等症状,甚至感染人引起中毒性休克或败血症而导致死亡,严重危害养猪业发展及人类健康。猪链球菌血清型众多,不同血清型的... 详细信息

猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人畜共患病病原,感染猪或人后可引起脑膜炎、败血症、关节炎等症状,甚至感染人引起中毒性休克或败血症而导致死亡,严重危害养猪业发展及人类健康。猪链球菌血清型众多,不同血清型的猪链球菌其致病力及分布情况有明显差异。目前已发现的猪链球菌毒力因子有80多种,但这些毒力因子并不是存在于所有猪链球菌当中,同一毒力因子在不同菌株中发挥的作用也并不完全相同,所以对于新分离的菌株的分子生物学研究有助于了解猪链球菌的分子特性及遗传变异情况,为猪链球菌的病原学特性的研究提供参考。1 猪链球菌CZ130302糖基水解酶CZGH25功能研究本研究通过提取猪链球菌CZ130302的分泌蛋白并作MALDI-TOF MS分析,鉴定出11种分泌蛋白并选取其中的CZGH25蛋白做后续研究。CZGH25属于糖基水解酶25家族（GH25）,大小约为45 KDa,是一种链球菌特异性水解酶。有关猪链球菌糖基水解酶的研究报道较少,为进一步研究CZGH25的生物学功能,构建了△SS-CZGH25缺失株,通过间接免疫荧光试验证实该蛋白在CZ130302中表达且分泌到胞外;细胞黏附能力比较发现,相对于野生株缺失株对HEp-2细胞的黏附能力下降20%;用相同剂量的菌攻毒小鼠,感染野生株的小鼠全部死亡而感染缺失株的小鼠存活率达40%,且缺失株在血、脑、肾、肺各脏器中的定植能力比野生株低10%左右;Far-Western blot发现CZGH25蛋白可与纤维蛋白原（Fg）发生特异性结合,这些结果均提示CZGH25是CZ130302的一个毒力因子;小鼠用CZGH25蛋白免疫后对CZ130302的攻击有37%的存活率,提示CZGH25蛋白对小鼠有一定的免疫保护作用;缺失czgh25基因后CZ130302的自溶能力有所上升,对酸及H2O2的敏感性显著增加,提示CZGH25参与CZ130302对外界环境应激的抵抗。2 猪链球菌WH1609基因组分析本实验室于2016年在临床分离到一株9型猪链球菌,命名为WH1609,该菌株对小鼠有很强致病力,对WH1609作进一步研究可加深对猪链球菌致病机制的了解。以斑马鱼为动物模型测得WH1609的LD50为3.16×102 CFU/mL,其毒力是猪链球菌强毒株的105倍左右;药物敏感性试验显示WH1609对氨基糖苷类、林可霉素类及大环内酯类抗生素耐药,对青霉素类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、万古霉素敏感,该结果与国内外报道大体相似;对WH1609进行全基因组测序,通过多种在线工具对其基因组分析发现WH1609中存在3个较大基因岛、3个前噬菌体、61个毒力相关因子及11个耐药基因,推测这些与细菌的毒力和耐药基因转移相关;基因组比较分析发现WH1609存在大规模重排、插入及倒位;核心基因进化分析发现WH1609能够和9型D12菌株形成独立的进化分支,与该菌株的亲缘关系最为接近。

关键词：猪链球菌糖基水解酶毒力因子抗应激基因组分析