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基因文库构建与目的基因筛选疑难问题分析

中学生物教学 2022年第12期 61-62页

作者：张伟健浙江省温州市第八高级中学 325000

对基因文库的构建过程及从基因文库中筛选目的基因的方法等几个疑难问题进行了简要分析,为高中生物学中相关内容的教学提供参考.

关键词：基因文库 cDNA文库生物学教学

藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和基因文库的构建

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微生物学报 2016年第2期56卷 209-218页

作者：成雪晴朱涛邓子新由德林上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以p... 详细信息

【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以pCClFOS^(TM)载体,大肠杆菌EP1300^(TM)-T1~R为宿主菌构建Fosmid文库。随后,设计引物,利用"板池-行池-单克隆"的三级PCR方法对文库进行快速筛选。【结果】pPM927、pSET152和pJTU1278均成功转入藤黄生孢链霉菌NRRL 2401,其中pSET152载体的转化效率最高。构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的基因文库,含2880个克隆,平均插入片段大小约为35 kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.99%,覆盖基因组16.5倍。同时,初步筛选出可能含有吲哚霉素生物合成基因簇的9个阳性克隆。【结论】成功构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和高质量的基因文库,为克隆该菌中次级代谢产物生物合成基因簇以及进一步遗传改造奠定了基础。

关键词：藤黄生孢链霉菌接合转移基因文库 PCR筛选

日本血吸虫期别差异表达基因文库的构建及分析

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生物化学与生物物理进展 2005年第11期32卷 1038-1046页

作者：苑纯秀冯新港林矫矫李浩陆珂石耀军傅志强刘金明蔡幼民中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室上海市动物生物技术研究中心上海200232

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交(suppressedsubtractivehybridization,SSH)技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库.经消减效率分析和三种文库克隆的EST的期别差... 详细信息

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交(suppressedsubtractivehybridization,SSH)技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库.经消减效率分析和三种文库克隆的EST的期别差异性鉴定,表明所建文库质量较高,为在整个基因组水平分离血吸虫的差异表达基因提供了重要材料.由三个文库选择257个插入片段大于500bp的克隆测定了EST序列.同源性分析结果表明257个EST代表182种血吸虫基因,其中有22种为血吸虫已知基因,有128种为血吸虫已知EST,有32种为新发现的血吸虫基因.对EST编码蛋白的功能预测结果显示:尾蚴消减文库的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;虫卵消减文库的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;成虫消减文库的基因多参与蛋白质的合成、转运及分解代谢,参与虫体的运动等.大规模分离、分析血吸虫期别差异表达基因将对从分子水平去解读血吸虫的生长发育机制,筛选高效疫苗候选抗原、药物靶标及诊断制剂有重要意义.

关键词：日本血吸虫期别差异表达基因文库

鸭病毒性肠炎病毒基因文库的构建及其核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定

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高技术通讯 2006年第9期16卷 948-953页

作者：程安春汪铭书文明周伟光郭宇飞贾仁勇徐超袁桂萍刘一尘四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心动物疫病与人类健康四川省重点实验室雅安625014 贵州大学生命科学院贵阳550025 内蒙古农业大学动物科技学院呼和浩特010018 河南科技大学生命科学院洛阳471000

提取鸭病毒性肠炎病毒（DEV）基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK（＋）连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼... 详细信息

提取鸭病毒性肠炎病毒（DEV）基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK（＋）连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼接后获得大于100bp以上ORF共187个,将其中一个含完整ORF的DNA片段,以BLASTX软件与Genbank上相应基因进行比对分析,初步确定为一种核衣壳蛋白基因.根据该基因片段序列,设计引物对DEV DNA进行PCR扩增,并克隆到pGEM-T载体上,转化宿主菌JM109,提取阳性重组质粒,经PCR检测、酶切鉴定、测序和生物信息学分析,确定该基因片段为DEV核衣壳蛋白基因.

关键词：鸭病毒性肠炎病毒基因文库核衣壳蛋白基因

喜盐芽孢杆菌D8基因文库的构建及甘氨酸甜菜碱转运蛋白betH基因的筛选

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微生物学报 2005年第3期45卷 451-454页

作者：卢伟东赵百锁冯德芹王磊杨苏声中国农业大学生物学院农业部农业微生物资源及其应用重点开放实验室北京100094

喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)D8是一株产生芽孢的革兰氏阳性中度嗜盐菌,能够耐受2 5 %NaCl。以其总DNASau3AI部分酶切的片段为供体、pUC18为载体,构建了该菌株的基因文库,共获得约90 0 0个重组质粒。通过菌落原位杂交、菌落PCR检测及DNA... 详细信息

喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)D8是一株产生芽孢的革兰氏阳性中度嗜盐菌,能够耐受2 5 %NaCl。以其总DNASau3AI部分酶切的片段为供体、pUC18为载体,构建了该菌株的基因文库,共获得约90 0 0个重组质粒。通过菌落原位杂交、菌落PCR检测及DNA序列测定,从该文库中筛选到含有完整的甘氨酸甜菜碱次级转运系统基因的重组质粒,将此基因命名为betH基因。序列分析发现,betH基因的大小为15 15bp ,编码由5 0 5个氨基酸组成的BetH蛋白,分子量为5 6 1kD。经蛋白疏水性分析,推测为含有12个跨膜区的跨膜蛋白,与Oceanobacillusiheyensis甘氨酸甜菜碱转运蛋白、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)OpuD、楚氏喜盐芽孢杆菌(Halobacillustrueperi)BetH、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)BetL、嗜盐海球菌(Marinococcushalophilus)BetM和耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)甘氨酸甜菜碱转运蛋白的氨基酸同源性分别为6 4 %、5 1%、4 9%、4 8%、4 3%和4 4 %。

关键词：喜盐芽孢杆菌(Halobacillus) 基因文库甘氨酸甜菜碱转运蛋白

产氢细菌Ethanoligenens harbinense YUAN-3基因文库构建及分析

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哈尔滨工业大学学报 2010年第10期42卷 1586-1590页

作者：赵鑫邢德峰王静怡张璐任南琪哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室哈尔滨150090

以高效产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌的模式菌株YUAN-3作为出发菌株,提取细菌总DNA,经过Sau3AI的不完全酶切,将2.5～5.0kb的片段连接入用BamHI酶切的pUC19质粒,转化入E.ColiDH5α中,构建菌株YUAN-3的基因组文库,得到克隆数接近9×103个,以... 详细信息

以高效产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌的模式菌株YUAN-3作为出发菌株,提取细菌总DNA,经过Sau3AI的不完全酶切,将2.5～5.0kb的片段连接入用BamHI酶切的pUC19质粒,转化入E.ColiDH5α中,构建菌株YUAN-3的基因组文库,得到克隆数接近9×103个,以最相近的梭菌属已报道的基因组平均大小4.6Mb计算,概括了其99%以上的基因组,达到了建库的理论值.随机挑取200个白色菌落进行测序,经分析得到的结果大多数与已经过全序列分析的产氢细菌的假想蛋白相近,其中有49个与其他菌株功能蛋白相似性超过70%的片段,包括叶酰聚谷氨酸合成酶、DNA拓扑异构酶、乙酰转移酶等,同时获得了7个功能蛋白或基因的完整开放阅读框.

关键词：生物制氢基因文库产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌

Frankia基因文库的构建及与根瘤菌结瘤基因区同源克隆的筛选

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Acta Genetica Sinica 1990年第5期17卷 405-410页

作者：崔玉海秦敏王焰玲丁鉴马庆生广西农学院分子遗传学研究室中科院沈阳应用生态研究所

应用无色肽酶(Achromopeptidase)加溶菌酶系统破壁,提取分别来自色赤杨、细枝木麻黄和沙棘的3株代表性Frankia菌株的总DNA。以可在很多革兰氏阴性细菌中稳定复制和诱动转移的广谱寄主性质粒pLAFR1为载体,构建了其基因组文库。基于经EcoR... 详细信息

应用无色肽酶(Achromopeptidase)加溶菌酶系统破壁,提取分别来自色赤杨、细枝木麻黄和沙棘的3株代表性Frankia菌株的总DNA。以可在很多革兰氏阴性细菌中稳定复制和诱动转移的广谱寄主性质粒pLAFR1为载体,构建了其基因组文库。基于经EcoRI酶切后的Frankia总DNA中有与根瘤菌结瘤基因同源性的片段,以豌豆根瘤菌结瘤基因为探针,通过菌落原位杂交对文库进行了筛选,较强杂交克隆经斑点杂交复筛,初步得到了几个阳性克隆,为进一步研究Frankia的结瘤基因及有关共生固氮的其它基因奠定了基础。

关键词： Frankia 基因文库结瘤基因

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

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中国临床康复 2005年第19期9卷 94-96,i002页

作者：崔丽娟赵晓山罗仁周琳李玉萍南方医科大学南方医院中医科广东省广州市510515 广州中医药大学第二附属医院广东省中医院内科广东省广州市510515 南方医科大学南方医院内分泌科广东省广州市510515

目的:运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法:选择2004-08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例,符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚... 详细信息

目的:运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法:选择2004-08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例,符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断,肝肾功能正常,无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒,构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量;基因组DNARsaI酶切产物;消减杂交产物扩增结果;蓝白斑筛选阳性克隆;聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果:用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段,基因组DNA经过RasI酶切消化后,所得DNA片段主要集中在200～2000bp;消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后,产物明显增多,内含数条隐约可见的条带,主要集中在0.2～1.5kb;蓝白斑α互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆,结果正向消减杂交产物得到286个克隆,反向消减杂交产物得到262个克隆;随机挑取92个阳性克隆,经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段,大小为200～1000bp,从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。

关键词：糖尿病,非胰岛素依赖型肾阴虚杂交基因文库

节杆菌BT801基因文库构建及其乙内酰脲酶基因分离与表达

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生物工程学报 2003年第3期19卷 281-285页

作者：郝淑凤张惟材袁红杰王恒梁黄留玉军事医学科学院生物工程研究所中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳110016

L 乙内酰脲酶产生菌节杆菌BT80 1的染色体DNA经Sau3AI部分酶切后分离 30kb左右的片段 ,与经HpaI和PstI酶切的黏粒载体pKC5 0 5进行连接 ,将连接产物用包装蛋白包装 ,转染大肠杆菌DH5α得到 10 0 0 0多个转化子 ,构建成节杆菌BT80 1的基... 详细信息

L 乙内酰脲酶产生菌节杆菌BT80 1的染色体DNA经Sau3AI部分酶切后分离 30kb左右的片段 ,与经HpaI和PstI酶切的黏粒载体pKC5 0 5进行连接 ,将连接产物用包装蛋白包装 ,转染大肠杆菌DH5α得到 10 0 0 0多个转化子 ,构建成节杆菌BT80 1的基因组文库。通过薄层层析等方法筛选得到了 1个阳性克隆 ,通过亚克隆得到了乙内酰脲酶的完整基因。

关键词：乙内酰脲酶节杆菌基因文库基因表达