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腺病毒介导的BMP-2基因转染BMSCs复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的实验研究

腺病毒介导的BMP-2基因转染BMSCs复合纳米羟基磷灰石体外构建组织...

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作者：何春耒广州医学院

学位级别：硕士

【目的】由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的难题之一,植骨术是解决这一问题的主要方法。现阶段方法的弊端或局限性主要有供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、移植排斥反应等。近年来由支架... 详细信息

【目的】由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的难题之一,植骨术是解决这一问题的主要方法。现阶段方法的弊端或局限性主要有供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、移植排斥反应等。近年来由支架材料、种子细胞和生长因子复合构建的组织工程骨可以改进上述弊端,为临床治疗骨缺损的修复带来美好的前景。本实验将探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2表达载体转染后对BMSCs增殖及成骨转化的影响,在此基础上,进一步观察转染BMP-2基因的rBMSCs在Nano-HA支架中粘附、增殖情况构建仿生人工骨,利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外构建了仿生人工骨,为进一步应用此组织工程骨修复骨缺损奠定基础。【方法】 1.取2～3月龄健康新西兰大白兔一只,无菌条件下用18号骨髓穿刺针从胫骨结节外侧穿刺抽取骨髓3～4mL,采用Percoll(1.073 g/ml)分离液分离培养骨髓中BMSCs细胞,留备下一步实验。其中少量细胞进行形态学观察,细胞生长曲线,并采用成骨细胞诱导条件培养基培养,钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。 2.部分传代培养的rBMSCs细胞,以腺病毒为载体携目的基因BMP-2/GFP转染rBMSCs,转染后传代培养备用。取部分转染细胞进行如下鉴定: Ad-GFP转染效率的检测,免疫组化、RT-PCR、western blot检测Ad-BMP-2转染后目的基因在rBMSCs的表达。 3.胰酶消化收集上述培养的第三代细胞及转染48h后的第三代细胞,制成单细胞悬液,把细胞悬液均匀接种预湿的Nano-HA材料块,材料与细胞复合培养后第d3、d7,分别取两组材料,通过扫描电镜观察材料表面细胞附着、分布、生长情况。Western Blot检测复合后细胞BMP-2蛋白的表达。【结果】 1.原代及传代rBMSCs均表现为长梭形改变,呈涡旋状、放射状排列,连续传代培养生长良好,使用条件培养基传代培养3周后,经诱导鉴定可向成骨细胞转化,茜素红染色阳性并形成矿化结节,细胞呈集落生长后开始形成钙结节。 2. Ad-BMP-2转染后细胞形态规则,生长旺盛,随培养时间延长细胞体积变大由长梭形向多角形改变的趋势,转染后细胞BMP-2免疫组化检测结果显示胞浆呈阳性表达;RT-PCR检测到大小约338bp大小的阳性条带,转染后细胞BMP-2基因不同时期mRNA水平有高表达;Western-blot检测到约30kD大小的阳性条带,转染后Ad-BMP-2转染组有BMP阳性条带,且随时间的增长条带呈强阳性,而未转染组可见较弱的条带,病毒转染rBMSCs细胞后在蛋白水平也有高表达。 3.复合培养3天后,扫描电镜见载体表面不规则,其间可见微孔并且部分被细胞覆盖,转染后的细胞在Nano-HA材料块陷窝和空隙中粘附良好,密集处连接成片,细胞贴附伸展良好。复合7天后细胞在材料表面完全铺展,并伸出伪足,与材料表面融合紧密,细胞周缘可见钙盐分泌及沉积。提取细胞载体复合上的细胞,western-blot检测转染组在第三、第五天有BMP-2蛋白有高表达,转染后的细胞载体复合物可继续分泌BMP-2。【结论】 ***细胞取材方便,采用密度梯度离心法能分离获得大量实验用BMSCs。BMSCs培养性能稳定,便于传代扩增,在一定诱导条件下可转化为成骨细胞,适合于作为骨组织工程的种子细胞。 2.采用GatewayTM技术构建了携带hBMP-2的重组腺病毒载体,能高效转染培养的骨髓间充质干细胞,转然后能够高效、持续表达、分泌BMP-2蛋白。 3.成功体外构建BMP-2基因强化的组织工程仿生人工骨。

关键词：骨形态发生蛋白类骨髓细胞组织工程腺病毒载体纳米羟基磷灰石骨缺损基因治疗基因强化的组织工程

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