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工业微生物 2014年第1期44卷 34-39页

作者：王志臻仝艳军杨海麟王武江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

以NCBI报道的Comamonas testosteroni ATCC11996中3α-羟类固醇脱氢酶基因(3α-hydroxysteroid dehydrogenase gene,3α-hsd,AF092031.2)为模板,通过改变碱基序列但不影响酶的氨基酸序列,将该基因相对于大肠杆菌的密码子适用指数由0.78提高到0.87,GC含量由原来的63.17降低到56.46,大幅度减少了GC簇及寡聚A和T局域的存在,提高3α—hsd的可表达性。全合成基因定向克隆到pET28a载体中,并转化至大肠杆菌B121(DE3)中表达。采用乳糖诱导后,SDS—PAGE检测在约27 kD处有一高效表达的蛋白条带。采用Ni螯合柱分离纯化3α-HSD,获得了较高纯度及较高的产率。酶学性质初步分析表明,全基因合成表达的3α-HSD的性质与原始的3α-HSD基本相同。

关键词： 3α-羟类固醇脱氢酶基因全合成密码子优化重组DNA表达酶学性质

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全基因合成方法学研究(英文)

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应用与环境生物学报 2007年第4期13卷 515-518页

作者：牛丹丹王正祥江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214036

通过基因全合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段,因此,建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要.本研究报道了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合... 详细信息

通过基因全合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段,因此,建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要.本研究报道了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法.此方法包含经DNA2.0软件的序列优化,Gene2Oligo软件的寡核苷酸设计,覆盖全长基因双链的寡核苷酸的组合和引物介导下的全基因的合成等步骤.运用此方法,对3个不同长度的基因(分别为653bp,1309bp和1498bp)成功地进行了密码子优化和一步全合成.其中的amyFF在大肠杆菌中表达量提高了12倍.

关键词：基因全合成组合PCR 基因设计

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3α-羟类固醇脱氢酶的密码子优化表达、亲和纯化及酶性质研究

3α-羟类固醇脱氢酶的密码子优化表达、亲和纯化及酶性质研究

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作者：王志臻江南大学

学位级别：硕士

3α-羟类固醇脱氢酶(3α-Hydroxy-SteroidDehydrogenase，3α-HSD，EC1.***.1.50)属于短链脱氢酶(SDR)家族成员之一，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅基，能够可逆地催化类固醇分子中第三位上羟基的氧化与还原。在临床上是用来检测血清... 详细信息

3α-羟类固醇脱氢酶(3α-Hydroxy-SteroidDehydrogenase，3α-HSD，EC1.***.1.50)属于短链脱氢酶(SDR)家族成员之一，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅基，能够可逆地催化类固醇分子中第三位上羟基的氧化与还原。在临床上是用来检测血清中总胆汁酸的含量的关键酶。本论文通过优化3α-HSD基因密码子，合成3α-HSD基因全序列，建立一种快速有效地获取3α-HSD的方法;通过添加乳糖增强诱导表达，提高3α-HSD酶产率;以及探讨了3α-HSD的亲和纯化方法及相关酶学性质。以来源于睾酮丛毛单胞菌ComamonastestosteroneATCC11996中的3α-hsd(AF092031.2)作为模板，对3α-hsd基因进行序列分析，根据克隆受体菌大肠杆菌中的密码子偏爱性进行密码子优化，优化了GC含量比，调整了部分GC及AT密集域的序列，做到合理地改变碱基但不影响酶的氨基酸序列，使该基因相对于大肠杆菌的密码子适用指数由0.78提高到0.87;GC含量比由原来的63.17%降低到56.46%，密码子改变率达到53.5%。探索了天然诱导物乳糖和合成诱导物IPTG对含有不同载体(pET28a-hsd,pTrc99a-hsd)的宿主菌的生长及3α-HSD表达的影响，最终选择10g/L乳糖作为诱导浓度，并对影响3α-HSD表达的其他条件进行探索，最佳诱导起始生物量为菌体浓度(DCW)2.0g/L，最佳诱导时长为12h。通过初步优化，3α-HSD的表达量为可达到5120U/L。对3α-HSD的纯化方法进行探讨，由于pET28a-hsd表达的3α-HSD在N端含有组氨酸标签，所以首先选用Ni-NTA进行纯化，确定了用HisTRapFF对3α-HSD进行纯化时最佳的洗脱条件为100mmol/L的咪唑，纯化后，比酶活为3.94U/mg，纯化倍数为3.84倍，蛋白得率为64.1%。后期设计了以脱氧胆酸为配体的底物亲和介质B-1，对B-1介质的进行了静态吸附试验，确定了其最大吸附量Qmax为21.3mg/g，平衡解离常数Kd为4.5μg/g。选用B-1进行亲和层析，获得了较好的纯化效果，比酶活为15.4U/mg，纯化倍数为7.76倍，蛋白得率为73.2%。对纯化后所得的3α-HSD进行基本性质分析，其最适温度为35℃左右，温度超过50℃，酶活损失较快，适合低温保存。3α-HSD的最适反应pH值因辅因子的不同而不同，选用NAD为辅因子时最适pH值为10.5，选用Thio-NAD为辅因子时最适pH为9.5，pH稳定范围为8.51.5。分析了不同金属离子对酶性质的影响，总结了金属离子使3α-HSD催化活性发生改变的可能机制。进行了以脱氧胆酸为底物的定量分析，结果表明以Thio-NAD为辅因子催化脱氧胆酸脱氢的效率是NAD的1.79倍。

关键词： 3α-羟类固醇脱氢酶基因全合成密码子优化亲和纯化酶学性质

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