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tat-血红素氧合酶-1融合蛋白对原位肝移植术大鼠肝损伤的影响

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中华麻醉学杂志 2015年第4期35卷 490-492页

作者：岳立辉朱喜春张东杜雪芳赵砚丽河北省人民医院麻醉科石家庄市050051

目的评价tat-血红素氧合酶-1（tat-HO-1）融合蛋白对原位肝移植术大鼠肝损伤的影响.方法选择健康成年雄性近交系Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,8～10周龄,体重180～230 g.采用随机数字表法,将受体大鼠分为2组（n=6）：肝移植组（OLT... 详细信息

目的评价tat-血红素氧合酶-1（tat-HO-1）融合蛋白对原位肝移植术大鼠肝损伤的影响.方法选择健康成年雄性近交系Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,8～10周龄,体重180～230 g.采用随机数字表法,将受体大鼠分为2组（n=6）：肝移植组（OLT组）和tat-HO-1融合蛋白组（tat-HO-1组）.采用改良Kamada二袖套法建立原位肝移植术模型.tat-HO-1组植入经含tat-HO-1融合蛋白50μg/ml的HTK液冷保存6h的肝脏.于移植后7d,经腹主动脉采血样2 ml,测定血清ALT和AST的活性.取肝脏,HE染色,光镜下观察肝组织病理学结果,计算排斥活动指数.采用ELISA法检测肝组织转化生长因子-β1（TGF-β1）及IL-6的含量.分离Kupffer细胞培养,测定培养液TGF-β1及IL-6的水平.结果与OLT组比较,tat-HO-1组血清ALT及AST的活性、排斥活动指数、肝组织和Kupffer细胞培养液TGF-β1及IL-6的水平降低（P＜0.05）,肝组织病理学损伤减轻.结论在供肝冷保存期间,应用tat-HO-1融合蛋白可减轻原位肝移植术大鼠肝损伤.

关键词：基因产物,tat 血红素加氧酶-1 肝移植再灌注损伤

His-tat-mCherry融合蛋白的跨膜转导及其在细胞内的定位

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解放军医学杂志 2009年第2期34卷 147-150页

作者：陈茜宋方丽刘亚伟杨勤姜勇贵阳医学院病理生理教研室贵阳 550000 南方医科大学病理生理教研室

目的构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-tat)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HIV-tat的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HIV-tat的跨膜转导机制及其定位提供重要工具。方法采用基因重组技... 详细信息

目的构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-tat)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HIV-tat的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HIV-tat的跨膜转导机制及其定位提供重要工具。方法采用基因重组技术构建含HIV-tat以及红色荧光蛋白的质粒pET14b-His-tat-mCherry,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,将该质粒转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,使其在体外表达,并进行纯化、除菌。将纯化的His-tat-mCherry融合蛋白与Hela细胞共同孵育,荧光显微镜下观察。结果PCR、双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;表达纯化出了高纯度的His-tat-mCher-ry融合蛋白。荧光显微镜下见Hela细胞中红色荧光蛋白主要分布在胞质中,细胞膜上也有一定分布。结论成功构建了pET14b-His-tat-mCherry原核表达质粒,纯化了高纯度的His-tat-mCherry融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞中有跨膜转导活性,为研究HIV-tat的跨膜转导机制提供了一个重要的工具。

关键词：基因产物,tat 红色荧光蛋白跨膜转导

HIV tat_(49-57)增强人乳头瘤病毒16E7细胞毒性T细胞表位穿膜效应研究

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中华皮肤科杂志 2006年第5期39卷 285-288页

作者：尹锐郝飞郝进钟白玉曹红卫第三军医大学西南医院皮肤科重庆400038 第三军医大学西南医院中心实验室重庆400038

目的探讨有穿膜序列HIV tat_(49-57)的人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位融合肽的跨膜能力及其影响因素。方法在HPV16E7 HLA-A2^+/H-2k^(b+)限制性CTL表位E7_(49-57)的N末端连接穿膜肽HIV tat_(49-57)序列,应用固相技... 详细信息

目的探讨有穿膜序列HIV tat_(49-57)的人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位融合肽的跨膜能力及其影响因素。方法在HPV16E7 HLA-A2^+/H-2k^(b+)限制性CTL表位E7_(49-57)的N末端连接穿膜肽HIV tat_(49-57)序列,应用固相技术合成此融合肽,用间接免疫荧光与激光共聚焦显微技术,研究其穿膜能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其体外诱导特异性CTL杀伤效应。结果穿膜序列HIV tat_(49-57)可以有效促进HPV16E7_(49-57)表位肽进入BHK细胞胞浆,并呈时间、剂量依赖关系(P＜0．05)；与原表位肽相比,该融合肽有显著地激发特异性CTL活性的能力。结论在原CTL表位基础上引入穿膜序列,可以使其更快速、更有效地进入活细胞胞浆,为HPV16肽疫苗的设计提供一种新的思路。

关键词：基因产物,tat 表位,T淋巴细胞蛋白质转运疫苗,亚单位

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tat蛋白与Plk1相互作用位点的鉴定

军事医学 2011年第10期35卷 749-753页

作者：杨天一张士猛尚增甫刘晓丹周平坤军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

目的确定tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点。方法构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位。结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现tat蛋白... 详细信息

目的确定tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点。方法构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位。结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域,激光共聚焦发现tat蛋白和Plk1在细胞核内有相同的亚细胞定位。结论 tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域引起Plk1 T210的磷酸化水平提高,从而激活Plk1的活性,导致细胞周期的紊乱。

关键词：基因产物,tat Plk1 基因表达显微镜检查,共聚焦细胞周期转染

tat-血红素氧合酶-1融合蛋白对L-02细胞的转导效果

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中华麻醉学杂志 2008年第5期28卷 444-447页

作者：赵砚丽郭娜岳立辉彭彦辉陈静卢大儒河北省人民医院麻醉科石家庄市050051 河北省人民医院普外科复旦大学遗传所

目的观察tat-血红素氧合酶-1（HO-1）融合蛋白对L-02细胞的转导能力、细胞毒性和转导后细胞内HO-1活性，评价其转导效果。方法L-02细胞与FITC标记的tat-HO-1融合蛋白孵育4h后，荧光显微镜下观察tat-HO-1融合蛋白转导入L-02细胞的情况。L... 详细信息

目的观察tat-血红素氧合酶-1（HO-1）融合蛋白对L-02细胞的转导能力、细胞毒性和转导后细胞内HO-1活性，评价其转导效果。方法L-02细胞与FITC标记的tat-HO-1融合蛋白孵育4h后，荧光显微镜下观察tat-HO-1融合蛋白转导入L-02细胞的情况。L-02细胞与tat-HO-1融合蛋白孵育4h后，采用CCK-8方法测定L-02细胞的活力，采用化学法测定HO-1活性。结果与FITC标记的tat-HO-1融合蛋白孵育后，L-02细胞内均匀分布绿色荧光；与tat-HO-1融合蛋白孵育后，L-02细胞活力无明显改变，HO-1活性明显升高。结论tat-HO-1融合蛋白可有效地转导入L-02细胞，可明显提高细胞内HO-1活性，且无细胞毒性。

关键词：血红素氧化酶(脱环) 基因产物,tat 肝细胞

tat-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠原位肝移植肝细胞凋亡的影响

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TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠原位肝移植肝细胞凋亡的影响

作者：杜雪芳河北医科大学

学位级别：硕士

目的:肝脏缺血再灌注损伤导致的移植肝脏功能衰竭或早期无功能是原位肝脏移植术后的严重并发症。研究表明,肝细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤的重要机制之一。有研究报道,通过运用药物、器官缺血预处理、热休克等诱导血红素氧合酶-1（HO-1... 详细信息

目的:肝脏缺血再灌注损伤导致的移植肝脏功能衰竭或早期无功能是原位肝脏移植术后的严重并发症。研究表明,肝细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤的重要机制之一。有研究报道,通过运用药物、器官缺血预处理、热休克等诱导血红素氧合酶-1（HO-1,热休克蛋白32）高表达,可以减轻器官的缺血再灌注损伤。HO-1是机体血红素分解代谢过程中的限速酶,催化血红素氧化分解产生一氧化碳（CO）、胆绿素和Fe2+,具有抗凋亡、抗氧化损伤、减轻炎症反应等作用,在器官保护方面引起了国内外学者的广泛关注。蛋白结构转导域（PTDs）是一小段不依赖于传统的受体或细胞吞噬作用、可以自由地穿过生物膜的肽链,蛋白质或多肽与PTDs相连后可进入细胞内保持其活性并发挥其生物功能。其中,包含11氨基酸（肽序列:YGRKKRRQRRR）的HIV反式激活蛋白（tat）是目前研究最广泛的蛋白结构转导域。有研究证实,tat与HO-1的融合蛋白（tat-HO-1）可以在大鼠心脏冷保存期成功转导进入心肌细胞并保持其生物活性,延长心脏冷保存期时间、减轻移植心脏的缺血再灌注损伤。但关于其在肝移植缺血再灌注损伤中作用的研究鲜有报道。本研究前期实验证实,tat-HO-1融合蛋白可以有效转导进入离体培养的L-02细胞及在体大鼠肝脏细胞、在冷保存期可转导进入大鼠肝脏并减轻肝实质细胞和肝窦内皮细胞（SECs）凋亡,对肝功能有一定的保护作用。本研究探讨tat与HO-1融合蛋白能否转导入大鼠原位肝移植肝细胞,以及对移植肝脏功能和细胞凋亡情况的影响。方法:将HO-1 cDNA编码区与合成的tat-PTD片断连接到原核表达载体pET32a上,构建tat-HO-1-pET32a质粒,经测序鉴定后,转化*** BL-21（DE3）菌株,IPTG诱导表达、Ni-NTA-agarose（Novagen公司,德国）纯化,Western blot法对tat-HO-1进行定性分析,化学法检测tat-HO-1活性,证实所得蛋白为有活性的tat-HO-1融合蛋白（1mg/ml）后进行动物实验。健康成年雄性SD大鼠,体重250～280g,按随机数字表随机分为供体组和受体组。将受体大鼠随机分为2组（n=24）:对照组（C组）和蛋白组（P组）。参照Kamada等的二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。C组和P组分别于肝移植术毕经阴茎背静脉注射生理盐水10ml/kg、tat-HO-1融合蛋白10ml/kg（10mg/kg）。两组分别于分离肝脏血管及周围韧带完毕切取肝脏前即刻（T0）、肝脏移植术后1h （T1）、6h （T2）和12h （T3）时各随机选取6只大鼠,乙醚麻醉后开腹经腹主动脉采血3ml分离血清,并切取肝组织标本立即液氮冷冻,血清与肝组织均置于-80℃冰箱保存。应用免疫组化染色法检测肝脏组织HO-1含量,分析tat-HO-1转导进入肝脏的情况。全自动生化分析仪测定血清ALT水平,放射免疫分析法检测血清HA水平。原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL）法分别检测肝实质细胞和SECs凋亡情况,荧光实时定量PCR法（RT-PCR）检测caspase-3 mRNA表达水平。苏木素-伊红（HE）染色,光镜下观察肝组织病理学变化。结果:1肝组织中HO-1含量两组肝脏移植术后1h、6h、12h肝组织中可见明显棕黄色HO-1阳性染色分布;与C组相比,P组肝组织中HO-1含量均高于C组（P0.05）,T13时均降低,差异有统计学意义（P0.05）,T13时均降低,差异有统计学意义（Ptat-HO-1融合蛋白在大鼠原位肝移植术后经静脉注射可以转导进入大鼠移植肝脏,可能通过下调Caspase-3 mRNA表达水平,减轻肝实质细胞和SECs凋亡,从而对大鼠肝移植术后的肝脏功能发挥保护作用。蛋白转导技术有望成为减轻肝移植肝脏缺血再灌注损伤的新措施。

关键词：基因产物,tat 蛋白转导血红素氧合酶-1 肝移植凋亡 Caspase-3

tat-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠供肝冷保存期氧化和炎症反应的影响

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TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠供肝冷保存期氧化和炎症反应的...

作者：王茂爱河北医科大学

学位级别：硕士

目的:原位肝移植现已广泛用于终末期肝病治疗,有研究报导术后1年60-65%发生免疫排斥反应。其主要原因之一是供肝冷保存期氧化和炎性损伤。目前由于供肝资源紧缺,如何有效保护供肝,减少移植肝脏的无功能的发生率更加受到了人们的重视。H... 详细信息

目的:原位肝移植现已广泛用于终末期肝病治疗,有研究报导术后1年60-65%发生免疫排斥反应。其主要原因之一是供肝冷保存期氧化和炎性损伤。目前由于供肝资源紧缺,如何有效保护供肝,减少移植肝脏的无功能的发生率更加受到了人们的重视。HO-1蛋白是机体血红素分解代谢的限速酶,分解产生一氧化碳(CO)、胆绿素和Fe,具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡、下调血管内皮细胞细胞间黏附分子表达、减少血管损伤、增加移植器官的血流灌注等作用,引起国内外学者的广泛关注。蛋白转导结构域(protein transduction domain , PTDs)是一小段可以直接透过细胞膜的多肽,蛋白质或多肽与PTDs相连后可进入细胞内发挥生物功能。HIV-1反式激活蛋白tat是目前研究较多的PTDs之一。tat可将与其相连的蛋白转导入肝、肾、心肌以及脑等器官组织。有研究证实,tat与HO-1的融合蛋白(tat-HO-1)可以成功转导进入胰腺βTC-3细胞,并可显著提高细胞活力。本研究前期实验证实tat-HO-1可以转导进入大鼠在体肝组织细胞,证实其可清除自由基,增强超氧化物歧化酶(SOD)活性,减轻脂质过氧化反应。本研究在前期研究基础上,对tat-HO-1在大鼠供肝冷保存期间是否能进入肝组织细胞以及是否有效对供肝提供抗氧化和抗炎症之保护作用,进行进一步探讨。方法:对含有tat-HO-1-pET32a质粒的*** BL-21(DE3)菌株进行培养,用IPTG诱导tat-HO-1-pET32a表达、Ni-NTA-agarose纯化,Western blot法对tat-HO-1进行定性分析,化学法检测tat-HO-1活性,证实所得蛋白为有活性的tat-HO-1融合蛋白后进行动物实验。选择雄性SD大鼠60只,体重250～300g。其中,12只用于tat-HO-1转导进入肝脏情况的研究。48只用于tat-HO-1对冷保存肝脏保护作用的研究。根据所用保存液的不同按照随机数字表分为两组:C组,肝脏应用4℃HTK液进行灌注和冷保存;P组,肝脏应用4℃含tat-HO-1 50μg/ml的HTK液进行灌注和冷保存。参照Kamada等的方法切取肝脏。取下肝脏置于相应保存液40ml中4℃保存。各组分别于冷保存0h、6h、12h和18h取材,抽取保存液及肝组织标本立即置于-80℃冰箱保存。应用免疫组化染色法检测肝脏组织HO-1含量,分析tat-HO-1转导进入肝脏的情况。应用Selectra-E全自动生化分析仪(Vital,荷兰)测定保存液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)含量。硫代巴比妥酸(TBA)法测定肝组织中MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。采用免疫组化法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)(试剂盒有武汉博士德生物试剂公司提供)。苏木素-伊红(HE)染色,在光镜和电镜下观察供肝组织形态学改变。结果: 1纯化所得蛋白为tat-HO-1蛋白,该蛋白可在冷保存期转导进入大鼠肝脏。 2保存液中ALT、AST及LDH水平测定结果组内比较:两组保存液中ALT、AST及LDH浓度均随着保存时间的延长而增高,上述指标,两两时间点比较,差异均有统计学意义(P0.05);在6h、12h和18h保存时间点,蛋白组保存液中ALT、AST及LDH浓度明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);在6h、12h和18h时,蛋白组肝组织中MDA和TNF-α含量明显低于HTK组,SOD活性则明显高于对照组,差异有统计学意义(Ptat-HO-1可在冷保存期转导进入大鼠肝脏。HTK液中加入tat-HO-1

关键词：肝血红素氧合酶超氧化物歧化酶丙二醛肿瘤坏死因子-α 器官保存基因产物,tat

融合蛋白tat-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究

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中华临床医师杂志（电子版） 2011年第19期5卷 5583-5589页

作者：唐旭张雪霞江洪波苟兴春四川中医药高等专科学校病理学教研室四川绵阳621000 四川中医药高等专科学校基础护理学教研室四川绵阳621000 四川中医药高等专科学校药学检验系四川绵阳621000 西安医学院细胞生物学转化医学研究室

目的观察融合蛋白tat-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度tat-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并... 详细信息

目的观察融合蛋白tat-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度tat-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予tat-NEP1-40、tat-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察tat-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用。结果 (1)tat-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,最大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,tat-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,Ptat-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用。

关键词：基因产物,tat 缺血 PC12细胞细胞凋亡 NEP1-40 蛋白转导

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tat疫苗研究新进展

国际生物制品学杂志 2008年第1期31卷 15-17+26页

作者：陈璐邓松华潘卫安徽医科大学病理生理教研室第二军医大学微生物教研室

HIV-1 tat 蛋白在病毒基因的复制、表达及 AIDS 的发病中起重要作用;tat 蛋白本身结构的特点也使其成为 HIV 疫苗研究的新靶点。但在 tat 疫苗研发过程中也遇到了诸多问题,如诱导的抗体滴度低,对病毒变异株抗原交叉反应性差而导致对异... 详细信息

HIV-1 tat 蛋白在病毒基因的复制、表达及 AIDS 的发病中起重要作用;tat 蛋白本身结构的特点也使其成为 HIV 疫苗研究的新靶点。但在 tat 疫苗研发过程中也遇到了诸多问题,如诱导的抗体滴度低,对病毒变异株抗原交叉反应性差而导致对异源性病毒攻击的防御效果不佳,不能引起足够的细胞免疫应答等。目前新研发的 tat Oyi 疫苗在提高抗体效价、交叉反应性和细胞免疫应答等方面有明显效果。本文就以上相关方面内容作一综述。

关键词：基因产物,tat 艾滋病疫苗 HIV