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NF-κB报告基因重组腺病毒的构建及活性分析

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北京大学学报（医学版） 2012年第6期44卷 954-959页

作者：郭金海王峰王平章赵丽石太平陈英玉北京大学基础医学院免疫学系卫生部医学免疫重点实验室北京100191 国家人类基因组北方研究中心北京100176 北京大学人类疾病基因研究中心北京100191

目的:探讨基于腺病毒载体的核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)报告基因系统作为NF-κB上游调控信号分子筛选模型的可行性。方法:利用5型E1/E3缺陷型腺病毒载体pAdxsi构建NF-κB报告基因的重组腺病毒,并利用该腺病毒感染多种贴壁细... 详细信息

目的:探讨基于腺病毒载体的核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)报告基因系统作为NF-κB上游调控信号分子筛选模型的可行性。方法:利用5型E1/E3缺陷型腺病毒载体pAdxsi构建NF-κB报告基因的重组腺病毒,并利用该腺病毒感染多种贴壁细胞和悬浮细胞进行NF-κB报告基因的活性分析。结果:成功构建了NF-κB报告基因重组腺病毒Ad-NF-κB-luc,其能够感染HepG2、MGC803、THP-1、U937等细胞,肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激显示重组腺病毒携带的NF-κB报告基因具有活性。结论:以腺病毒Ad-NF-κB-luc作为NF-κB报告基因的转移载体,不仅可以感染常规方法难以转染的细胞系,而且产生的报告基因活性稳定可靠,拓展了NF-κB报告基因的应用范畴。

关键词： NF-κB 腺病毒基因,报告萤光素酶类

基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的建立

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中国药理学与毒理学杂志 2009年第3期23卷 225-231页

作者：杨潇陈祥贵张晟西华大学生物工程学院四川成都610039

目的建立用于大规模筛选胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶(IRTK)激动剂的细胞模型。方法将含有编码胰岛素受体(IR)基因、转录激活因子5B(STAT5B)基因和STAT5应答元件调控的荧光素酶基因的质粒瞬时共转染仓鼠卵巢(CHO)细胞,人肝癌细胞HepG2和小... 详细信息

目的建立用于大规模筛选胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶(IRTK)激动剂的细胞模型。方法将含有编码胰岛素受体(IR)基因、转录激活因子5B(STAT5B)基因和STAT5应答元件调控的荧光素酶基因的质粒瞬时共转染仓鼠卵巢(CHO)细胞,人肝癌细胞HepG2和小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12,将具有较高的胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞经G418筛选,获得具有胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞克隆。RT-PCR检测外源基因的表达的稳定性。荧光素酶活性分析和MTT法检测胰岛素处理后荧光素酶诱导表达的量效关系,以及AG1024和AG490处理后胰岛素诱导荧光素酶表达的特异性。并在96孔板上优化荧光素酶的检测条件。结果共转染的CHO细胞较HepG2和C2C12表现出更高胰岛素诱导的荧光素酶活性,经G418筛选得到一株具有较高诱导表达率的细胞克隆。RT-PCR表明,该细胞克隆表达外源胰岛素受体和STAT5B。该细胞中荧光素酶的诱导表达对于胰岛素具有剂量依赖性。IRTK抑制剂AG1024能阻断胰岛素诱导荧光素酶的表达,而Jak激酶抑制剂AG490无此作用。在96孔板上的荧光素酶的优化检测条件为:接种量每孔15×103个细胞,受试物诱导表达8h,Promega荧光素酶检测试剂按推荐量进行4倍稀释使用。结论在转基因CHO细胞中,IRTK的激活能灵敏、特异地诱导荧光素酶的表达。因此,该细胞模型可用于IRTK激动剂的高通量筛选。

关键词：受体,胰岛素基因,报告药物筛选细胞,培养的

家兔心脏报告基因表达的单光子发射计算机断层显像研究

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中华心血管病杂志 2009年第6期37卷 548-553页

作者：刘影兰晓莉张亮吴涛蒋日烽张永学华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科湖北省分子影像重点实验室武汉430022

目的以单纯疱疹病毒1-胸苷激酶（HSV1-tk）为报告基因，以131^I标记的氟-碘阿糖基脲嘧啶（FIAU）为报告探针，对心肌内转染HSV1-tk的家兔行心脏报告基因单光子发射计算机断层（SPECT）显像，以探讨该报告系统应用于SPECT心脏报告基因显... 详细信息

目的以单纯疱疹病毒1-胸苷激酶（HSV1-tk）为报告基因，以131^I标记的氟-碘阿糖基脲嘧啶（FIAU）为报告探针，对心肌内转染HSV1-tk的家兔行心脏报告基因单光子发射计算机断层（SPECT）显像，以探讨该报告系统应用于SPECT心脏报告基因显像的可行性，为SPECT报告基因心脏显像最佳转染滴度、显像时间选择提供依据。方法制作腺病毒（Ad）为载体携带HSV1-tk基因的重组体Ad—tk，家兔心肌内注射Ad-tk。实验分2部分：（1）转染报告基因后不同时间对显像的影响：家兔心肌注射不同滴度的Ad—tk（1×10^9、5×10^8、1×10^8、5×10^7、1×10^7pfu），2d后耳缘静脉注射131^I—FIAU600μCi行6、24、48和72h心肌SPECT显像，注射1×10^9pfu Ad—tk的家兔继续行96和120h显像。（2）不同Ad-tk滴度对显像的影响：家兔心肌注射不同滴度的Ad-tk（1×10^9、5×10^8、1×10^8、5×10^7、1×10^7pfu），2d后耳缘静脉注射131^I-FIAU600μCi行6、24和48h心肌SPECT显像，显像结束后处死家兔，取出心脏，测量γ计数值，行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）研究，并对SPECT图像和RT-PCR图像行半定量分析。结果SPECT图像可见Ad-tk在注射局部表达，而非注射部位未见表达，对照组心肌除6h可隐约显影外，其余时间均未见显影。RT-PCR证实HSV1-tk在注射部位表达。不同的Ad-tk滴度，SPECT靶／非靶比值与γ计数值呈正相关（r^2=0．933，P〈0．01），与HSV1-tk的表达亦呈正相关（r^2=0．877，P〈0．01）。SPECT可检测到滴度低至1×10^7pfu的Ad—tk在心肌内的表达。结论应用HSV1-tk为报告基因，FIAU为报告探针的SPECT心肌报告基因显像是可行的。SPECT心肌报告基因显像可半定量地监测报告基因在体内的表达。

关键词：基因,报告体层摄影术,发射型计算机,单光子心脏

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报告基因在大鼠心肌中表达的放射性自显影

中华心血管病杂志 2009年第10期37卷 925-930页

作者：刘影兰晓莉吴涛尹小花张永学华中科技大学协和医院核医学科湖北省分子影像重点实验室武汉430022

目的以单纯疱疹病毒1-胸苷激酶（HSV1-tk）为报告基因，以^131I标记的氟．碘阿糖基脲嘧啶（FIAU）为报告探针，对转染HSV1-tk基因的大鼠心肌组织行放射性自显影（ARG）研究，以探讨该报告系统用于心脏报告基因显像的可行性，并为显像的... 详细信息

目的以单纯疱疹病毒1-胸苷激酶（HSV1-tk）为报告基因，以^131I标记的氟．碘阿糖基脲嘧啶（FIAU）为报告探针，对转染HSV1-tk基因的大鼠心肌组织行放射性自显影（ARG）研究，以探讨该报告系统用于心脏报告基因显像的可行性，并为显像的最佳病毒滴度和显像时间提供理论基础。方法制作腺病毒（Ad）为载体携带HSV1-tk基因的重组体Ad5-tk及空载病毒（Ad5-null），SD大鼠心肌内注射Ad5-tk及Ad5-null。根据目的不同进行分组如下：（1）转染报告基因后时间对显像的影响：心肌内转染1×10^8 pfu Ad5-tk后第1、2、3、5、7天注射^131I-FIAU；（2）转染不同病毒滴度对显像的影响：心肌内注射不同滴度的Ad5-tk（5×10^8，1×10^8，5×10^7，1×10^7pfu），2d后注射^131I-FIAU。对照组均采用注射同体积的Ad5-null。注射^131I-FIAU 24h后断颈法处死大鼠，取出心脏，测量γ计数值，行ARG研究，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从mRNA水平证实，并对ARG图像和RT-PCR图像行半定量分析。结果ARG及RT-PCR图像上均可见局部报告基因的表达随感染滴度的增加而增高，随感染时间的延长而降低。半定量分析证实在滴度和时间上RT-PCR及γ计数与放射性自显影呈相关关系：不同滴度Ad5-tk转染大鼠心肌细胞，RT—PCR与ARG相关系数r^2=0．963，P〈0．05，γ计数与ARG相关系数r^2=0．996，P〈0．01；不同时间Ad5-tk转染大鼠心肌细胞，RT—PCR与ARG相关系数r^2=0．950，P〈0．05，γ计数与ARG相关系数r^2=0．980，P〈0．01。结论应用ARG方法证实HSV1-tk为报告基因，FIAU为报告探针的系统可以用于心肌报告基因显像，显像最佳的转染滴度为1×10^8pfu，最佳的显像时间为转染后24～48h，为在体进行报告基因心脏显像提供了理论基础。

关键词：心脏基因,报告放射自显影术

远红荧光蛋白报告基因mKate2对肝癌细胞的标记及荧光成像

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中华医学杂志 2011年第19期91卷 1344-1347页

作者：李丹沈敏张波李征然庞鹏飞朱康顺王劲黄明声孟晓春单鸿中山大学附属第三医院放射科分子影像学实验室中山大学介入放射学研究所广州510630

目的制备远红荧光蛋白报告基因mKate2慢病毒,用于标记人肝癌细胞株HepG2,并进行体外的细胞荧光成像,为肿瘤的活体荧光成像示踪提供基础.方法以pmKate2-N质粒为模板,将mKate2基因克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST;pLenti6.3-mKa... 详细信息

目的制备远红荧光蛋白报告基因mKate2慢病毒,用于标记人肝癌细胞株HepG2,并进行体外的细胞荧光成像,为肿瘤的活体荧光成像示踪提供基础.方法以pmKate2-N质粒为模板,将mKate2基因克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST;pLenti6.3-mKate2表达质粒和包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并测定慢病毒的活性滴度;mKate2慢病毒以病毒感染复数（MOI）=6感染HepG2 96 h后,通过荧光显微镜观察和流式细胞分析法（FACS）检测感染效率;收集2×106个mKate2-HepG2细胞,通过光学成像系统进行荧光成像,确定最佳成像参数.结果测序结果显示,mKate2基因序列正确,无突变或缺失;mKate2慢病毒的活性滴度为1.6×106TU/ml;mKate2慢病毒感染HepG2 96 h后,荧光显微镜下观察到大量红色荧光蛋白的表达,FACS检测显示mKate2的阳性率为93.8%±0.4%;激发光（530±15）nm和发射光（710±28）am为对mKate2-HepG2细胞进行荧光成像的最佳参数.结论慢病毒能够介导远红荧光蛋白报告基因mKate2对人肝癌细胞株HepG2的高效标记,并且mKate2标记的HepG2能够进行体外细胞荧光成像,可以用于下一步的活体肿瘤示踪研究.

关键词：远红荧光蛋白基因,报告肝肿瘤

新型核素报告基因系统hERL／核素标记雌二醇的实验研究

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中华核医学与分子影像杂志 2012年第1期32卷 10-15页

作者：兰晓莉覃春霞田月丽夏晓天何勇袁辉张永学华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科、分子影像湖北省重点实验室、生物靶向治疗教育部重点实验室武汉430022

目的在体外细胞摄取实验及在体显像基础上，评价新型核素报告基因系统人ER配体结合域（hERL）／核素标记雌二醇（E2）应用的可行性，为其用于基因治疗的监测提供依据。方法以内部核糖体进入位点序列（IRES）方式构建携带hERL和治疗VEGF... 详细信息

目的在体外细胞摄取实验及在体显像基础上，评价新型核素报告基因系统人ER配体结合域（hERL）／核素标记雌二醇（E2）应用的可行性，为其用于基因治疗的监测提供依据。方法以内部核糖体进入位点序列（IRES）方式构建携带hERL和治疗VEGF165的重组质粒***165（简写为EIV），将其用腺病毒包装构建重组腺病毒复合体（Ad-EIV）。采用悬浮贴壁法从sD大鼠股骨和胫骨原代提取骨髓MSCs并培养。将Ad-EIV和脂质体2000包裹重组质粒（Lipo-EIV）分别转染MSCs，利用RT-PCR和Westernblot，对hERL和VEGF165mRNA和蛋白质水平的表达分别进行检测。测定***组、***组和未转染组MSCs对125I-E在不同时间（1、3,6、9、12和24h）的摄取率。将转染Ad-EIV的MSCs注射至大鼠左前肢、未转染MSCs注射至右前肢后1d，注射16a-^18TMF-17a-E2（^18F-FES）进行micro PET／CT活体显像。2组间均数比较采用t检验，相关性研究采用Pearson相关分析。结果Ad—EIV转染MSCs后RT—PCR检测示hERL和VEGFl65mRNA的表达随着感染滴度的增加而增加，且呈正相关（r2分别为0．953和0．966，P均〈0．05）；感染复数（MOI）=25、50、75和100时，其mRNA表达高于Lipo-EIV组。Westernblot检测蛋白质水平的表达也得到同样的结果。Ad-EIV组和Lipo-EIV组MSCs对^125I-E2的摄取率均随时间延长逐渐增高，24h最高，分别达到（10．94±0．30）％和（8．934-0．18）％；各个时间点2种载体转染组均明显高于未转染对照组（3．54％-5．52％；t值分别为15．489-26．560、10．523-24．204，P均〈0．05），而Ad-EIV组摄取率高于Lipo-EIV组（t=g．132—16．168，P均〈0．05）。MicroPET／CT大鼠活体显像显示注射Ad-EIV转染的MSCs之左前肢放射性浓聚明显高于对侧。结论报告基因hERL可以通过腺病毒转染、脂质体包裹等多种形式转染细胞并成功表达，应用核素标记E2可以对其进行探测和显像。应用腺病毒转染报告基因的方式转染率更高。

关键词：基因,报告雌激素受体配体结合域放射性核素显像雌二醇同位素标记大鼠

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

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中国生物制品学杂志 2012年第9期25卷 1130-1134页

作者：高明珠朱瑞宇陈蕴金坚江南大学医药学院药物设计与分子药理学实验室江苏无锡214122

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点... 详细信息

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。

关键词：启动子基因,报告真核细胞基因表达

含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的辛德毕斯病毒的制备与鉴定

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中华实验和临床病毒学杂志 2013年第3期27卷 228-230页

作者：邓玲玲李江姣尉研王焕琴张凤娟孙继国陈畅朱武洋梁国栋北京化工大学生命科学与技术学院北京100029 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所脑炎室

目的制备含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因的辛德毕斯病毒,并对其进行鉴定.方法采用融合PCR技术将报告基因EGFP融合到辛德毕斯病毒XJ-160感染性克隆pBR-XJ160的结构基因编码框后,并在报告... 详细信息

目的制备含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因的辛德毕斯病毒,并对其进行鉴定.方法采用融合PCR技术将报告基因EGFP融合到辛德毕斯病毒XJ-160感染性克隆pBR-XJ160的结构基因编码框后,并在报告基因前面添加亚基因启动子SP6,通过反向遗传学技术拯救得到EGFP标记的辛德毕斯病毒.结果成功拯救并获得了EGFP标记的XJ-160病毒,该重组病毒具有良好的荧光表达特性和遗传稳定性.结论 EGFP标记的辛德毕斯病毒可用于观测病毒的侵染轨迹,为进一步研究辛德毕斯病毒嗜性、生物学功能,以及感染机制奠定了基础.

关键词： Sindbis病毒基因,报告克隆,分子

腺病毒介导荧光素酶报告基因感染间充质干细胞的研究

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中华核医学与分子影像杂志 2013年第6期33卷 -页

作者：王一帆夏睿郭玉林郜发宝 610041 成都四川大学华西医院放射科分子影像研究室四川大学华西医院放射科分子影像研究室成都610041 宁夏医科大学总医院放射科

目的构建携带萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的腺病毒载体(Ad-Luc),研究其感染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)后的体内外生物发光成像.方法从psiCHECK-2质粒中用PCR扩增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV后行Nhe Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切... 详细信息

目的构建携带萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的腺病毒载体(Ad-Luc),研究其感染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)后的体内外生物发光成像.方法从psiCHECK-2质粒中用PCR扩增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV后行Nhe Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切和测序鉴定.重组腺病毒穿梭载体与骨架载体pAdeno同源重组并包装纯化后,测定其病毒滴度.用重组Ad-Luc感染BMSC,行体外生物发光成像确定最佳感染复数(MOI),并采用曲线拟合回归分析生物发光强度与MOI的关系.以锥虫蓝染色法评价细胞活力变化,计算细胞存活率.将转染后BMSC(1×106个)植入SD大鼠前肢肌肉内,行体内生物发光成像.细胞存活率组间比较采用两因素重复测量资料方差分析.结果经酶切和测序鉴定证明,Ad-Luc构建成功,病毒滴度为1×1010空斑形成单位(PFU)/ml.体外生物发光检测结果显示最佳MOI值为50,Ad-Luc可高效感染BMSC,使其表达Luc,且拟合曲线示细胞生物发光强度随MOI增加而增强(R2 =0.98).转染组和未转染组细胞培养1、3、5、7d时,细胞存活率分别为(92.5±2.3)％与(94.1±1.8)％、(91.4±0.9)％与(92.7±2.0)％、(92.1±1.6)％与(93.3±2.4)％、(91.9±1.5)％与(93.0±3.1)％,2组间细胞活力的差异无统计学意义(F=4.38,P＞0.05).体内生物发光成像结果示BMSC移植1、3、7d后仍有存活,但随时间延长,生物发光信号逐渐减弱.结论 Luc报告基因通过腺病毒载体成功转入BMSC,实现了光学报告基因成像对移植干细胞的示踪.

关键词：骨髓干细胞腺病毒,人荧光素酶基因,报告生物发光成像大鼠