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基于电镜多克隆表位鉴定技术（EMPEM）的新冠疫苗免疫效果分析

基于电镜多克隆表位鉴定技术（EMPEM）的新冠疫苗免疫效果分析

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作者：陈坤北京化工大学

学位级别：硕士

接种疫苗是预防疾病的有效途径之一,2019年新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的全球大流行加速了多种疫苗的研发,评估疫苗有效性的其中一个方面在于机体是否产生较多的广谱中和抗体(bn Abs),这类抗体能够识别严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2... 详细信息

接种疫苗是预防疾病的有效途径之一,2019年新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的全球大流行加速了多种疫苗的研发,评估疫苗有效性的其中一个方面在于机体是否产生较多的广谱中和抗体(bn Abs),这类抗体能够识别严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)不同突变株表面相对保守的区域,从而对各类突变株产生有效免疫保护作用。然而,现有的酶联免疫吸附试验(ELISA)和基于分离单克隆抗体识别表位的方法在鉴别bn Abs存在一定的局限性,ELISA不具备鉴别抗体靶向表位信息的能力,且单克隆抗体的制备过程既耗时又昂贵。基于电镜的多克隆表位鉴定技术(EMPEM)提供了一种新的途径,可以在不分离单克隆抗体的情况下,对血液中的多克隆抗体进行可视化分析,从而揭示抗体靶向表位的特异性、多样性以及抗原抗体复合物的结构生物学信息,这一技术的开发和应用,为实时快速评估机体疫苗接种后产生的多克隆抗体反应提供了新的分析方法。为应用EMPEM技术分析新冠疫苗免疫效果,我们首先对EMPEM流程进行优化,并用人源和鼠源血清验证了其可行性;其次,我们首次将EMPEM技术应用于小鼠的免疫学分析,探究了针对新冠的序贯免疫和同源强化免疫策略的免疫效果;最后,我们首次利用EMPEM探究以新型佐剂DNA水凝胶的亚单位疫苗(刺突蛋白Spike protein,受体结合区域RBD)的免疫效果。取得的研究成果如下:1.从减少血清用量和时间的角度对EMPEM流程优化,通过直接在血清中进行抗体消化、复合抗原以及电镜成像,我们提出了基于旋柱式离心EMPEM,随后我们使用了人源血清和鼠源血清验证了这种方法的可行性,并实现了时间和血清用量分别减少至传统EMPEM方法的20%和60%。2.使用EMPEM技术分析了同源强化和序贯免疫策略诱导小鼠产生多克隆抗体反应的不同。同源强化策略,如DNA疫苗和亚单位疫苗,在免疫应答上不如序贯免疫策略可以诱导机体产生较多种类和较高亲和力的抗体,在我们分析同源强化策略的结果中发现,DNA疫苗产生了靶向N端结构域(NTD)表位的多克隆抗体,而亚单位疫苗(Spike protein)产生靶向RBD表位的多克隆抗体;在DNA初免+亚单位蛋白疫苗加强的序贯免疫策略中发现了较多靶向非RBD表位的抗体,并观察到随着非RBD类抗体比例增加,中和滴度也随之增加,表明非RBD类抗体在新冠的免疫应答中扮演着关键的角色。3.使用EMPEM技术对以DNA水凝胶为佐剂亚单位疫苗的免疫效果进行评估。分别使用RBD二聚体和三聚体以及Spike蛋白全长作为免疫原,并比较不同时间点小鼠体内诱导的p Abs反应。我们发现RBD二聚体比RBD三聚体更能刺激机体产生靶向Spike蛋白的抗体,且DNA水凝胶佐剂相对于铝佐剂更能刺激机体产生保护性抗体,随后在对Spike蛋白免疫原的研究中,我们发现随着ELISA滴度的增加,更多种类和更高亲和力靶向抗原的多克隆抗体在电镜下被观察到,通过EMPEM,我们实现了对ELISA中抗体的结合滴度的具象化描述。

关键词： SARS-CoV-2 基于电镜表位定位 DNA疫苗亚单位疫苗序贯免疫 DNA水凝胶佐剂疫苗

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