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基于不同修饰电极的高灵敏均相电化学适体传感器研究

基于不同修饰电极的高灵敏均相电化学适体传感器研究

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作者：何亚媚浙江师范大学

学位级别：硕士

传统的电化学适体传感器通常需要将生物探针固定在电极上,不仅固定过程耗时费力,且探针与目标物之间的识别发生在溶液与电极界面,大大降低了其结合效率。为了解决这些问题,研究者提出让生物识别反应发生在均相溶液中,主要以铟锡氧化物(I... 详细信息

传统的电化学适体传感器通常需要将生物探针固定在电极上,不仅固定过程耗时费力,且探针与目标物之间的识别发生在溶液与电极界面,大大降低了其结合效率。为了解决这些问题,研究者提出让生物识别反应发生在均相溶液中,主要以铟锡氧化物(ITO)电极作为传感平台,利用信号分子与电极之间的扩散电流,来实现对目标物的检测。但在这类扩散介导的均相传感体系中,信号物质分散在均相溶液里而不能被充分利用,导致传感器的灵敏度受限;并且,ITO电极本身并不能放大信号。因此,仍需发展能有效输出并放大信号的均相传感平台。本论文制备了不同修饰电极,作为新型的均相电化学传感平台。这些平台不仅制备简便,还能有效地电催化或富集信号分子,实现信号的放大;再结合RecJ核酸外切酶(RecJ酶)诱导的目标循环放大,实现对凝血酶(TB)的高灵敏检测。主要工作如下:(1)基于石墨烯的催化放大及酶切目标循环的“信号减弱型”均相电化学适体传感器研究本工作以还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极(RGO/GCE)作为传感平台。发夹型DNA(HP)的3′突出端与凝血酶适体(TBA)互补配对,形成HP-TBA双链;HP-TBA双链不易吸附到RGO/GCE表面,该电极能检测到对尿酸(UA)较强的电催化氧化电流(I)。当加入目标物TB时,TB与TBA结合,形成TB-TBA复合物,释放出HP;HP可以通过突出的单链部分,利用π-π堆积作用,吸附到RGO/GCE表面,使电极的活性表面积降低,导致检测到的I下降。当进一步引入RecJ酶时,RecJ酶能从5′端识别并剪切TB-TBA中的单链,释放出TB;释放出来的TB继续与下一个HP-TBA中的TBA结合,开始酶切目标循环;更多的HP被释放出来,吸附在RGO/GCE表面;检测到的I将进一步减小。利用UA信号的降低,即可实现对目标物的检测。在优化的实验条件下,该适体传感器对凝血酶表现出良好的分析检测性能,如较宽的线性范围(5000 fmol L)、低的检测下限(0.86 fmol L,S/N=3)、良好的重现性和稳定性,并被成功应用于实际血样的检测中。(2)基于石墨烯的催化放大及酶切目标循环的“信号增强型”均相电化学适体传感器研究本工作以还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极(RGO/GCE)作为传感平台。设计的发夹型DNA包含了凝血酶适体序列,其5′端闭合,3′端突出,命名为TBA。没有TB时,由于5′端闭合,RecJ酶不能识别剪切TBA;TBA可以通过突出的单链部分,利用π-π堆积作用,吸附到RGO/GCE表面,使电极的活性表面积降低;此时,电极检测到的UA的催化氧化电流(I)较弱。当加入TB时,TB与TBA结合,形成TB-TBA复合物,不易吸附到RGO/GCE表面;检测到的I增强。进一步引入RecJ酶时,RecJ酶可以从5′端识别并剪切TB-TBA复合物中的TBA,释放出TB;释放出来的TB继续与TBA结合,促使更多的TBA被剪切,使得吸附到电极表面的TBA进一步减少;检测到的I进一步增强。利用UA信号的增强,即可实现对目标物的检测。在优化的实验条件下,该适体传感器对凝血酶表现出良好的分析检测性能,如较宽的线性范围(1000 fmol L)、低的检测下限(0.21 fmol L,S/N=3)、良好的重现性和稳定性,并被成功应用于实际血样的检测中。(3)基于环糊精竞争性主客体识别及酶切目标循环的比率型均相电化学适体传感器研究本工作以聚β-环糊精修饰的玻碳电极(pβ-CD/GCE)作为传感平台。发夹型DNA包含了凝血酶适体序列,其5′端闭合,3′端突出并修饰有罗丹明B(RB),命名为RB-TBA。没有目标物TB时,通过RB与β-CD之间的主客体识别作用,RB-TBA被带到电极表面;由于RB-TBA的遮挡,1-萘酚(1-Nap)不易接近电极;故检测到的RB电流信号(I)较高,而1-Nap电流信号(I)较低。加入TB时,RB-TBA与TB结合,形成RB-TBA/TB复合物;由于RB在TB表面,难与β-CD结合,电极表面的RB-TBA减少,曝露出一部分β-CD,1-Nap可以进入其空腔;此时检测到的I减小,而I增强。进一步引入RecJ酶时,RecJ酶可以从5′端识别并剪切RB-TBA/TB复合物中的TBA,释放出TB和RB;释放出的TB继续与RB-TBA结合,从而促使更多的RB-TBA被剪切,使得电极表面的RB-TBA进一步减少。释放出的RB虽可进入环糊精空腔,但会被1-Nap竞争取代。因此,I将进一步减小,而I将进一步增强。以I/I作为响应信号,即可实现对目标物的检测。在优化的实验条件下,该适体传感器对凝血酶表现出良好的分析检测性能,如较宽的线性范围(0.5000 fmol L)、低的检测下限(0.12 fmol L,S/N=3)、良好的重现性和稳定性,并被成功应用于实际血样

关键词：均相电化学适体传感器石墨烯环糊精凝血酶 RecJf核酸外切酶

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