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一种甲酯化n-C16-地衣素的分离及结构鉴定

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化学通报 2009年第11期72卷 1008-1012页

作者：李艺明杨世忠牟伯中华东理工大学应用化学研究所上海200237

经过酸沉淀分离、有机溶剂萃取和二步柱分离,从地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)HSN221菌株的培养液中分离纯化得到了一种地衣素类似物。经ESI-MS测定,该物质的分子量为1062Da;经对酸解后甲醇酯化的脂肪酸的GC/MS分析可知,该物质含... 详细信息

经过酸沉淀分离、有机溶剂萃取和二步柱分离,从地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)HSN221菌株的培养液中分离纯化得到了一种地衣素类似物。经ESI-MS测定,该物质的分子量为1062Da;经对酸解后甲醇酯化的脂肪酸的GC/MS分析可知,该物质含有3-羟基正十六烷酸残基;Q-TOFMS/MS的结果显示该物质具有GlnLeuLeuValAspMeLeuIle的肽链,因此,该物质为甲酯化的n-C16-地衣素。

关键词：脂肽地衣素分离结构地衣芽胞杆菌

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地衣芽胞杆菌CodY转录因子对地衣素生物合成的影响

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地衣芽胞杆菌CodY转录因子对地衣素生物合成的影响

作者：肖芳华中农业大学

学位级别：硕士

地衣素(Lichenysin)是一种脂肽类的生物表面活性剂,在石油开采、洗涤品、环境修复、农业等领域具有广阔的应用前景。然而,其生产成本高、产量低,限制了地衣素的大规模工业化生产及商业化应用。枯草芽胞杆菌CodY转录因子在富含氨基酸的... 详细信息

地衣素(Lichenysin)是一种脂肽类的生物表面活性剂,在石油开采、洗涤品、环境修复、农业等领域具有广阔的应用前景。然而,其生产成本高、产量低,限制了地衣素的大规模工业化生产及商业化应用。枯草芽胞杆菌CodY转录因子在富含氨基酸的条件下会阻遏支链氨基酸的合成,而支链氨基酸是地衣素生物合成的前体氨基酸,CodY可能影响地衣素的合成。本文研究了前体氨基酸的添加对出发菌株Bacilluslicheniformis WX02-Psrflch 发酵地衣素的影响,对出发菌株 WX02-Psrflch 进行定向改造得到高产地衣素的工程菌株,探索了cod 基因缺失对地衣素生物合成的影响。通过检测出发菌株WX02-Psrflch地衣素发酵过程中游离前体氨基酸的浓度变化发现,地衣素的组成氨基酸天冬氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的胞内积累量最大值分别只有 0.4mg/L、6.0mg/L、0.3mg/L、0.3mg/L、1.6mg/L。然而,在***02-Psrflch发酵地衣素的培养基中添加前体氨基酸(包括Val、lle、Leu、Asp和Glu)后,地衣素的产量反而出现不同程度的下降。CodY蛋白与地衣素生物合成的前体氨基酸之间有密切关系,为了明确这种关系,本研究以*** WX02-Psrflch为出发菌株,构建了一系列codY表达差异菌株:codY缺失菌株(WX02-PsrflchAcodY)及不同强度的游离表达菌株(WX02-Psrflch/pHY-P43codY、WX02-Psrflch/pHY-PsrfcodY)。以cod 缺失菌株为研究对象,优化了地衣素发酵的前体氨基酸添加策略,外源添加0.5 g/L混合氨基酸的效果最佳,地衣素产量比出发菌株提高了 25.7%,而codY强化表达菌株的地衣素产量显著下降。对比出发菌株和codY缺失菌株的地衣素分批发酵数据得出,codY缺失菌株的地衣素产量比出发菌株提高了 31.0%,发酵周期由36 h缩短至24 h。codY缺失菌株地衣素发酵的主要溢流代谢产物乙酸、乙偶姻及2,3-丁二醇的含量分别比出发菌株下降了 50.9%、41.4%和25.9%。胞内游离前体氨基酸的检测结果显示,在地衣素的快速合成时期6-12 h,除了两个菌株的Asp浓度基本一致,其余前体氨基酸(包括Val、Leu、lle、Gln)在codY缺失菌株的胞内积累量都高于出发菌株。表明codY缺失后减少了溢流代谢产物的合成,提高了胞内Gln、lle、Leu及Val的浓度。本研究进一步探讨了cod 缺失对地衣素合成途径及调控网络中关键基因表达的影响,qRT-PCR结果表明:codY缺失后,支链氨基酸合成相关的ilvA、ilvB、leuA、bcd及alsS基因的表达量都有不同程度的提高,Gln和Glu合成相关的gln1、rocG的表达量表现为上调,而参与Asp合成的aspB基因的表达量基本不变;地衣素合成基因lchAA以及地衣素合成相关的正调控因子comA和degU的表达量也表现为上调;参与主要溢流代谢产物乙酸、乙偶姻合成的关键基因ackA和alsD的表达量下降。以上结果表明,在***02-Psrflch中,cotdY基因的敲除可以减弱地衣素发酵过程中的溢流代谢途径,增强谷氨酰胺及支链氨基酸的生物合成及其关键基因的表达,同时能促进双组分调控蛋白ComQXPA及DegS-DegU的表达,进而提高地衣素的产量。本文首次探索了cod 基因缺失对地衣素生物合成的影响,并为地衣素的生产提供了科学指导和技术应用。

关键词：地衣芽胞杆菌地衣素 CodY蛋白转录因子氨基酸工程菌

地衣素染色显示石蜡切片内的乙型肝炎表面抗原

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新医学 1979年第9期 438-439页

作者：凌启波邓榜发谢泰章中山医学院病理解剖教研组

过去在病理石蜡切片上没有一种特殊性染色可以表明肝组织内有乙型肝炎病毒的存在。近年志方俊夫等人以及Bartok等和Nayak等用地衣素(Orceio,即地衣红)染色法在肝硬化的石蜡切片内显示出乙型肝炎表面抗原,并通过特异性的免疫荧光法和免... 详细信息

过去在病理石蜡切片上没有一种特殊性染色可以表明肝组织内有乙型肝炎病毒的存在。近年志方俊夫等人以及Bartok等和Nayak等用地衣素(Orceio,即地衣红)染色法在肝硬化的石蜡切片内显示出乙型肝炎表面抗原,并通过特异性的免疫荧光法和免疫过氧化酶法而证实。这对在硬化的肝脏内检定乙型肝炎表面抗原的存在是很有帮助的。

关键词：肝炎表面抗原石蜡切片阳性物质地衣素乙型

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地衣素及其在养猪上的应用潜力

猪业科学 2019年第1期36卷 88-90页

作者：张吉鹍湖北博大生物股份有限公司动物繁殖与营养工程技术中心湖北黄石435000 江西省农业科学院畜牧兽医研究所江西南昌330200

文章通过介绍芽孢杆菌在其代谢中所产生的地衣素的理化性质、化学结构的基础上,综述了地衣素的生理活性功能,并与枯草素、伊枯草素、丰原素进行了比较。指出地衣素比枯草素等具有更强的表面活性、抑菌活性、抗病毒活性和溶血活性,是替... 详细信息

文章通过介绍芽孢杆菌在其代谢中所产生的地衣素的理化性质、化学结构的基础上,综述了地衣素的生理活性功能,并与枯草素、伊枯草素、丰原素进行了比较。指出地衣素比枯草素等具有更强的表面活性、抑菌活性、抗病毒活性和溶血活性,是替代抗生素最具潜力的产品之一。但由于其得率低、生产成本高,限制了其应用。最后文章从菌种改造、发酵原料及优化工艺3个方面提出了地衣素的增产措施。

关键词：地衣素枯草素脂肽类化合物表面活性抑菌活性

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地衣素及其生理活性功能

中国饲料添加剂 2019年第1期 4-8页

作者：张吉鹃湖北博大生物股份有限公司动物繁殖与营养工程技术中心湖北黄石435000 江西省农业科学院畜牧兽医研究所江西南昌330200

本文在介绍芽孢杆菌在其代谢中所产生的地衣素的理化性质、化学结构的基础上,综述了地衣素的生理活性功能,并与枯草素、伊枯草素、丰原素进行了比较。指出地衣素比枯草素等具有更强的表面活性、抑菌活性、抗病毒活性和溶血活性,但由于... 详细信息

本文在介绍芽孢杆菌在其代谢中所产生的地衣素的理化性质、化学结构的基础上,综述了地衣素的生理活性功能,并与枯草素、伊枯草素、丰原素进行了比较。指出地衣素比枯草素等具有更强的表面活性、抑菌活性、抗病毒活性和溶血活性,但由于其得率低、生产成本高,限制了其应用。最后从菌种改造、发酵原料及优化工艺三个方面提出了地衣素的增产策略。

关键词：地衣素枯草素脂肽类化合物表面活性抑菌活性

具有调节NF-κB信号通路作用的微生物代谢产物筛选及分离纯化鉴定

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具有调节NF-κB信号通路作用的微生物代谢产物筛选及分离纯化鉴定

作者：邹云彭广西医科大学

学位级别：硕士

目的: NF-κB是普遍存在于细胞浆中的一种转录调节因子,很多疾病与NF-κB信号通路的激活和抑制有关。本课题建立了适合大量微生物代谢产物提取物的筛选和提取方法，采用双荧光素酶报告基因分析方法研究525种代谢产物对NF-κB信号通路的... 详细信息

目的: NF-κB是普遍存在于细胞浆中的一种转录调节因子,很多疾病与NF-κB信号通路的激活和抑制有关。本课题建立了适合大量微生物代谢产物提取物的筛选和提取方法，采用双荧光素酶报告基因分析方法研究525种代谢产物对NF-κB信号通路的激活和抑制情况，对筛选得到的活性菌株进行发酵罐发酵，对分离得到的化合物进行结构鉴定和生物活性评价，然后进一步做相关基础研究。方法：微生物接种液体培养基中，于180r/min、30℃摇床培养，3d后，加入终浓度70%的乙醇裂解过夜。裂解物离心，取上清，旋转蒸发浓缩并冷冻干燥，获得微生物代谢产物提取物，采用双荧光素酶报告基因分析方法进行筛选，将pNF-ΚB-luc、pRL-TK质粒共转染HEK293细胞，转染后6h加入微生物代谢产物或TNFα（阳性对照），继续培养24h后，检测荧光素酶活性。对3092#活性菌株进行大规模发酵，培养条件为可溶性淀粉1%、葡萄糖2%、牛肉膏0.1%、NaCl0.2%、K2HPO40.025%、酵母提取物1%、CaCO30.2%，PH=7。我们以此条件进行了三批发酵罐发酵，发酵液经过初步提取后得到35.7g粗提物。粗提物采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、TLC、HPLC等分离方法进行分离，化合物采用HR-MS、13C-NMR、1H-NMR等方法鉴别。对分离到的单体化合物进行双荧光素酶报告基因分析，研究这些化合物对NF-κB信号通路的激活和抑制情况结果：在第一轮筛选中，发现30种代谢物能够激活NF-κB信号通路;28种代谢物能够抑制NF-κB信号通路。在第二轮筛选中，有13种代谢物能够明显激活NF-κB信号通路，没有明显抑制NF-κB信号通路的代谢物。在第三轮筛选和最后验证中，发现６种代谢物均能激活NF-κB信号通路。从粗提物中得到一系列脂肽地衣素类物质（L31-L37）,通过与文献比对，确定结构如下：L32：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC13)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (anteisoC13)L34：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC14)。L36：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC15)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (anteisoC15)L33：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC13或anteisoC13)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Val7]-β-OH fatty acid(isoC14或anteisoC14)L35：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (nC14)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Val7]-β-OH fatty acid (nC15)此外，还分离到5个其他类单体化合物，分离鉴定了其中三个，名称分别为亮氨酸、正十六烷酸、3-羟基癸烷酸。

关键词： NF-κB 荧光素酶报告基因微生物代谢产物地衣素结构鉴定

地衣芽胞杆菌Lichenysin的生理功能及高产菌株构建

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地衣芽胞杆菌Lichenysin的生理功能及高产菌株构建

作者：刘晨华中农业大学

学位级别：硕士

芽胞杆菌合成的表面活性素是种表面活性很强的脂肽类物质,在微生物原油开采、生物修复、医药抗病毒等领域都具有很大的应用潜能。表面活性素Lichenysin发酵产量低、生产成本高,限制了它的应用推广和研究发展。另外脂肽类物质在其生产菌... 详细信息

芽胞杆菌合成的表面活性素是种表面活性很强的脂肽类物质,在微生物原油开采、生物修复、医药抗病毒等领域都具有很大的应用潜能。表面活性素Lichenysin发酵产量低、生产成本高,限制了它的应用推广和研究发展。另外脂肽类物质在其生产菌的生命周期中起到的作用也没有引起足够的重视。本研究的主要目的是构建Lichenysin高产菌株,并研究其在菌体生长中的调控作用。本研究对地衣芽孢杆菌*** WX-02全基因组测序的结果分析显示,该菌株具备Lichenysin合成的完整基因:编码合成酶体系的基因操纵.子lchA,及激活合成酶的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶PPTases的编码基因sfp。*** WX-02发酵液具有排油圈活性,收集上清提取纯化脂肽类物质。提取物进行HPLC-MS分析,结果显示,*** WX-02主要合成脂肪酸侧链别为C13、C14和C15的四种Lichenysin G同系物。Lichenysin的合成基因lchA启动子受ComA-P调控,其表达能力较弱。本研究通过基因工程技术,将lchA启动子PlchA替换为强启动子P43,构建成菌株WX-02 P43lchA。以Cooper基础培养基发酵,HPLC检测Lichenysin的相对含量,野生型WX-02 产量为 1249.6 ± 51.6 mAU×s,WX-02 P43lchA 产量为 2130.9 ± 23.3 mAU×s,工程菌WX-02P43lchA的Lichenysin,相比野生型产量提高了 70.53%。此外,敲除lchA的启动子PlchA,得到工程菌WX-02 △PlchA,该菌株同时阻断Lichenysin和ComS的合成;敲除lchA第三个开放阅读框lchAC得到工程菌WX-02 △lchAC,只阻断Lichenysin合成。检测以上两株工程菌的发酵液,都没有检测到Lichenysin,震荡产生的泡沫稀少,菌体生长没受到干扰,达到了构建低泡沫工程菌株的效果。测定野生型与三株工程菌的群游和生物膜合成能力,发现WX-02P43lchA比野生型有极大提高,而两株缺失株的能力则相对减弱或丧失。Lichenysin能促进微生物的群游与生物膜的形成,而这两方面能力又与生物定殖及生物防治息息相关。

关键词：地衣芽孢杆菌地衣素 lchA 工程菌株构建生理功能

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特殊染色

江苏医药 1979年第9期 47-50页

地衣素(Orcein)染色显示石蜡切片内的乙型肝炎表面抗原方法:石蜡切片厚4～5微米,常规用二甲苯脱蜡到水,用0.25％高锰酸钾硫酸液氧化5分钟(0.5％高锰酸钾水溶液,0.5％硫酸水溶液,两液在临用时等分混合,用滴管滴入盖过切片,每一玻片约需0.... 详细信息

地衣素(Orcein)染色显示石蜡切片内的乙型肝炎表面抗原方法:石蜡切片厚4～5微米,常规用二甲苯脱蜡到水,用0.25％高锰酸钾硫酸液氧化5分钟(0.5％高锰酸钾水溶液,0.5％硫酸水溶液,两液在临用时等分混合,用滴管滴入盖过切片,每一玻片约需0.5～1毫升巳足),入水稍洗,以2％草酸漂白5分钟,流水稍冲洗2～3分钟,70％酒精稍洗,置入酸化的地衣素酒精液内染3～5小时(地衣素1克,70％酒精100毫升,浓盐酸0.84毫升,先把浓盐酸倾入70％酒精,然后加入地衣素,搅拌溶解,翌日即可使用),70％酒精漂洗二次,每次约半分钟,常规脱水透明,最后以中性树胶封固。结果:肝细胞内的地衣素阳性物质染为深棕色或紫棕色,呈微细颗粒状或均质状。阳性物质可形成圆形或椭圆形的团块,也可充满整个胞浆,呈环形或半

关键词：石蜡切片地衣素苏木素蒸馏水洗阳性物质酒精脱水中性树胶二甲苯封固流水冲洗特殊染色酒精溶液脱蜡化工单元操作氢氧化银黑色素细胞缓冲液组织块

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地衣世界的故事

科学大众(中学生) 2002年第2期 8-9页

作者：林森

在广袤苍凉的大地上, 甚至连草木都无法生长的地方,仍然有绚烂的色彩点扮着世间。地衣俨然如这地球上最后一道彩色的生命风景线,虽然卑微渺小,不为人所重视,但依旧随着季节的流转,生生不息。

关键词：地衣素印地安人