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海枣曲霉地衣多糖酶和木聚糖酶的底物特异性

微生物学报 1987年第4期27卷 350-356页

作者：曾宇成张树政中国科学院微生物研究所

海枣曲霉木聚糖酶X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ作用于不同底物时,X-Ⅰ对地衣多糖的水解活性最强,对麦麸半纤维素H和B也有一定的水解活性,因而该酶为具有木聚糖酶活性的地衣多糖酶(Lichenase,1.3-1,4-β-D-Glucan 4-glucnohydrolase, EC 3.2.1. 73)... 详细信息

海枣曲霉木聚糖酶X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ作用于不同底物时,X-Ⅰ对地衣多糖的水解活性最强,对麦麸半纤维素H和B也有一定的水解活性,因而该酶为具有木聚糖酶活性的地衣多糖酶(Lichenase,1.3-1,4-β-D-Glucan 4-glucnohydrolase, EC 3.2.1. 73)。X-Ⅱ对燕麦木聚糖、麦麸半纤维素B和H均有很高的水解活性,对其他木聚糖及地衣多糖的水解活性也较高,因而为具有地衣多糖酶活性的木聚糖酶。X-Ⅲ对落叶松木聚糖的水解活性最高,对其他木聚糖也有较高的水解活性,但不能水解地衣多糖等β-葡聚糖,故为一种专一的木聚糖酶。X-Ⅰ水解麦麸半纤维素B, X-Ⅱ水解燕麦木聚搪及X-Ⅲ水解落叶松木聚糖的Km值分别为9.9,2.1和1. 8mg/ml。酶水解产物的纸层析分析结果表明,X-Ⅰ水解不同木聚糖后的产物主要为分子量较大的寡聚木糖,未发现木二糖、木糖及阿拉伯糖。X-Ⅱ的水解产物主要为木二糖及木二糖以上的寡糖,并有少量木糖和阿拉伯糖,且阿拉伯糖远多于木糖。X-Ⅲ的水解产物中以木二糖为最多,也有较多的木二糖以上的寡聚木糖,木糖和阿拉伯糖的量较少,且阿拉伯糖远少于木糖。

关键词：海枣曲霉地衣多糖酶木聚糖酶底物特异性

LPMOs及新型辅助蛋白协同水解地衣多糖及其作用机制

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LPMOs及新型辅助蛋白协同水解地衣多糖及其作用机制

作者：周蕊华侨大学

学位级别：硕士

可再生生物质能源为维持全球碳循环平衡、减缓全球变暖做出了重大贡献,符合可持续发展理念。生物质原料包括纤维素、半纤维素和木质素等。其中,利用可生物降解的多糖原料(如纤维素、地衣多糖、木葡聚糖、木聚糖、葡甘聚糖等)具有重大价... 详细信息

可再生生物质能源为维持全球碳循环平衡、减缓全球变暖做出了重大贡献,符合可持续发展理念。生物质原料包括纤维素、半纤维素和木质素等。其中,利用可生物降解的多糖原料(如纤维素、地衣多糖、木葡聚糖、木聚糖、葡甘聚糖等)具有重大价值。糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GHs),如纤维素酶、木聚糖酶、地衣多糖酶等,通过内/外切水解糖苷键将可生物降解的多糖水解成单糖、寡糖或它们的复合物,进而生产生物燃料。但由于多糖结构复杂,单一酶往往无法实现完全转化,寻找解决方案以实现多糖完全水解至关重要。为此,本论文开展了以下研究:首先,利用氧化裂解多糖之间糖苷键的溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMOs)与地衣多糖酶协同以实现多糖底物的完全水解。在大肠杆菌中成功表达了来源于细菌Micromonospora aurantiaca的LPMOs(Ma AA10),结果证明Ma AA10本身不会水解地衣多糖,而与地衣多糖酶发生协同作用时,还原糖含量增加了1.11倍。此外,Ma AA10发挥协同作用无需加入外源电子供体。同时,分步反应,即Ma AA10先预处理底物,再加入地衣多糖酶水解底物,可显著提高水解能力;与同步反应相比,相对还原糖量增加了48.8%。其次,Ma AA10与地衣多糖酶在40 h仍具有协同作用,且单酶和双酶的还原糖量分别为0.4 mg和0.512 mg,此时的双酶底物转化率为14.68%。最后,通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)再次证实了协同作用,即单酶和双酶的峰面积分别是48614和52018,且Ma AA10并未改变地衣多糖酶的内源水解模式,而是通过氧化裂解破坏多糖长链,以释放更多还原端,从而提高水解效率。其次,构建了一种新型辅助蛋白SCE,即类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide,ELPs)和Spy Catcher的嵌合体,实现了在大肠杆菌中的过量表达,并显著提高了地衣多糖酶的水解效率。当SCE蛋白只与地衣多糖反应时,并没有观察到还原糖含量的增加,但随着地衣多糖酶的加入,相对还原糖量增长了52%。此外,SCE蛋白与地衣多糖酶的协同体系对可溶性底物的酶活较高,但对不溶性底物的水解促进效果更好(比可溶性底物高约15%),说明在此协同体系中,地衣多糖酶的水解作用占主要地位,且SCE更倾向于促进不溶性底物的水解,这一特性与碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)类似。此外,与同步反应相比,分步反应的相对还原糖量增加了19%。SCE与地衣多糖酶在8 h协同作用效果最佳,且单酶和双酶的还原糖量分别为0.100 mg和0.223mg,此时的双酶底物转化率为6.22%。同时,通过生物信息学分析,亲和凝胶电泳和色氨酸荧光发射试验证实了SCE蛋白可以与地衣多糖底物结合。基于此,提出了SCE蛋白与底物及酶的可能作用机制。最后通过HPLC再次验证了协同效果,即单酶和双酶的峰面积分别是20362和38584,且SCE并未改变地衣多糖酶的内源水解模式,而是通过与底物结合,促使底物更接近地衣酶的催化结构域,从而提高它们的水解效率。与LPMOs相比,SCE蛋白更易制备,无需外源电子供体,促进效果更好,耗时短且过程稳定,因此在生物燃料和生物炼制中具有巨大的应用潜力。本研究成功构建并优化了两个地衣多糖酶协同体系(Ma AA10/Bgl SE和SCE/Bgl SE),分析了二者的水解模式,最后借助生物信息学分析和实验验证了SCE的作用机制,后者作为一种全新的协同体系,在生物炼制及生物燃料的生产中更具潜力,可为实现生物质的完全降解提供新思路。

关键词：地衣多糖酶溶解性多糖单加氧酶碳水化合物结合模块协同水解生物质降解

产β-葡聚糖酶菌种T199的选育及发酵条件

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微生物学报 2001年第6期41卷 750-752页

作者：石家骥崔福绵中国科学院微生物研究所北京100080

A mutant strain T199 producing about 8 times as much β-glucanase as its parent strain trichoderma kningii T3 was obtained by treatment with ultraviolet light and *** was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium consisted of 5% corn cob powder,3% wheat bran and 1.4% nitrogen source No.10 ((NH 4) 2SO 4 10%,Peptone 20%,Yeast extract 15%).The optima culture conditions were as below:initial pH5.0,30℃,shaking speed 280r/min,and cultivation time *** activity toward CMC-Na,lichenin,laminarin and barley β-glucan at pH 5.0 and 60℃ for 10min were 300,1100,12 and 1600 IU/mL,*** optima pH and temperature for enzyme action toward barley β-glucan were pH 5.0 and 70℃,*** enzyme was stable under below 50℃ and at pH 4.5～6.5.

关键词：康宁木霉 β-葡聚糖酶纤维素酶昆布多糖酶地衣多糖酶菌种选育发酵条件

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酶和发酵工程

生物技术通报 1989年第8期5卷 46-69页

892451 从 phane rochate chrysosporium得到的木质素过氧化物酶基因的结构和调节作用[英]/Holzbaur.E.L.F.…//***.-1988,155(2).-626～633[译自 DBA,1989,

关键词：葡聚糖酶基因克隆酿酒酵母酵母表达节杆菌木糖异构酶地衣多糖酶葡糖淀粉酶发酵工程芽抱杆菌

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酶工程

生物技术通报 1990年第10期6卷 54-67页

902666 来源于真菌 Y-94的β-葡糖苷酶的纯化和性质[英]/Yamanobe,T.…// ***.-1989,53(12).-3359～3360[译自 DBA,1990,9(6),90-03497]在30℃、pH4.0条件下,真菌菌株Y-94于培养基中振荡培养14天,培养基中含4%纤维素粉、1.5%细菌胨、

关键词：酶工程真菌菌株葡聚糖酶 β-葡糖苷酶酿酒酵母纤维素粉芽抱杆菌营养缺陷地衣多糖酶启动子